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• Original Classification: K
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C`.ESKOSLOVENSKA AKADEMIE VED
ACADEMIA SCIENTIARUM BOHEMOSLOVENICA
FOLIA
BIOLOGICA
TOMUS II
FASCICULUS 6
Fol. biol. (Praha) Tom. 2 - Fasc. 6 Praha 31. 12. 1956
Approved For Release 2008/04/10: CIA-RDP80T00246A002900500019-5
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FOLIA BIOLOGICA (PRAIA)
Medccayhapoarnoe uaa(mlie dceypIla.1oe Ceslcoslovenska biologie it Oeskoslove'lislca
mikrobiologie
P e a 111 ii o I I ii a a HOJIJie rH fl:
AHagenuH II. MAJIeiC (rTaii11hui pedal rop), B. Bplmlxci uii, Al. h~IIIIeH, '1JI.-Kopp. r-ICAH
(D. I'ep`1HH, aiiaJIeMHH 0. Ilpoliell, 10. Al,ulyp:l, aHageMHH C. Ilie r, U. Pol'llltt uo (ceig). pa'u.
11o nIeI11t), 11. IlepHblll, H. LU'repUJrb.
Ilepeliodli 11a pycellUil 1131!u: Moil. J-p I1Ilipoim, Ila aH ['All iicullii 1131,111: 9-p l'ii (,colla, lii I[e-
MCI11111ii s1II,!II: 3-1) Iaiil'Jlb
I133ICTCSI B1loapl'1I'ICcallM 111IC'1111yTON1 r1CSOl'.101111HOliA133CMliii 11111 IS 113;1[I'1'6Ib1"1'I1e rlt:All
BI,Ixo;Urr 6 pa3 II r0;1. Ilo;pnIult iIl Ike1t Il3l 1 ro;l How 611.-, 1lcll3 0,klloro I[Olllchn Il'le Itl.-.
A;lpec pe;lalnlnll: 13lloJlorli'Ieciuiii IIIICTTITyT LICAII, ll;l lilill'111IIIrIl 2, 111)3lri NIX. C;?IG I:IbI:
ApTlui, CMe lon 30, llpara II, '-Iexocaon;u;nn.
FOLIA BIOLOGICA (PRAHA)
International Edition of the Journals Ceslcoslovenska biologie and Ceskoslovensbi
mikrobiologie
Academician I. Malek (Chief Editor), L. Cerny, Al. Hayek, Correspondirig Member of the Czechoslovak
Academy of Science F. Hercik, Academician 0. Jirovec, J. D'lacura, Academician S. Prat, B. Rosicky
(Editorial Secretary), J. ~terzl, V. Vrsansky.
Translations into Russian: Dr Schierova, into English: Dr Ridesova, into German: Dr Feigel.
Issued by Biologicky ilstav Ceskoslovenske akadeinie vcd at Nakladatelstvi Cs. akademie vcd. Yearly
subscription (6 numbers) lies 60. Single number Kcs 10. Address: Biologicky ristav CSAV, Na cvicisti 2,
Praha XIX. Orders: Artier, Smecky 30, Praha II, Czechoslovakia.
FOLIA BIOLOGICA (PRAHA)
Internationale Ausgabe der Zeitschri f ten Ces/coslovenslcr biologie and Ceskoslovenska
mikrobiologie
Akaderiemitglied I. Malek (leitender Redakteur), L. Cerny, M. Hayek, korresp. Mitg]. d. Cs. Akademic
d. Wiss. F. Hercik, Akademiemitglied 0. Jirovec, J. Macura, Akademiemitglied S. Prat,
B. Rosieky (Redaktions-Sekretar), J. ~terzl, V. Vrsansky.
Die Vbersetzimgen besorgt Doz. Dr A. Schierova for die russischen, Dr A. Ridesova fur die
englischen and Dr T. Feigel fiir die cleutschen Artikcl.
Herausgeber: Biologicky ustav Ceskoslovenskcj akademie vcd lurch Vermittlung des Nakladatelstvi Cs.
akademie ved. 6 Lieferungen jahrlich. Abonnementpreis 60 Kos, Preis der Einzelnummer 10 Kcs.
Anschrift der Redaktion: Biologicky ustav CSAV, Na cvicisti 2, Praha XIX. Zu beziehen durch: Artia,
Smecky 30, Praha II, Ceskoslovensko.
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CESKOSLOVENSKA AKADEMIE V$D
ACADEMIA SCIENTIARUM BOHEMOSLOVENICA
FOLIA
BIOLOGICA
1956
KAKLAOATELSTVI
[CsAv]
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FOLIA BIOLOGICA (PRAHA)
Meoccayuapoaioe u3aauue ascypnaaoa Ceskoslovenskd biologie i'I Oeskoslovenska
mikrobiologie
Pega HgHOHHan HoJIJIe rH n:
AHaAeaaH H. MaJIeH (rJIaBHulft peAaHTOp), B. Bpmaucxnll, M. raulex, qn.-Hopp. LICAH
(D. I'epHH, aRaAeMnR O. Hpoeeq, 10. Magypa, allaAemHH C. HpaT, B. Pocngxnh (ceHp. peg.
Ho2JlerHH), JI. LIepubtli, H. HITepgJlb.
IIepenoAbt Ha pyccxuft n3biH: Aog. A-p lllupona, Ha anrnuftcxnh H3b1H: A-p PHAecona, Ha IIe-
Megxufi n3btx: A-p CDaiirnb
H3AaeTCn BnoJlornvecH*M 1HCTHTYTOM LIexOCJjonauNoft AHaAeMHH HayH B H3AaTejIbCTBe LICAH.
BbixoAnT 6 pa3 B roA. Hogmtcnan geua Ha 1 roi[ K`Ic 60.-, geHa oAHoro HoMepa K'Ic 10.-.
AApec peAangnn: BnonorugecHHi1 HHCTHTyT LICAH, Ha IBngaIuTU 2, Hpara XIX. 3axaabu:
ApTue, CMegnm 30, Hpara If, LlexocJioBauun.
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International Edition of the Journals Oeskoslovenskc biologie and Ueskoslovenska
mikrobiologie
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Internationale Ausgabe der Zeitschriften Ceskoslovenska biologie and Ceskoslovenskci
mikrobiologie
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Die I7bersetzungen besorgt Doz. Dr A. Schierova fur die russischen, Dr A. Ridesovh fur die
englischen and Dr T. Feigel fur die deutschen Artikel.
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akademie v6d. 6 Lieferungen jahrlich. Abonnementpreis 60 Kos, Preis der Einzelnummer 10 K6s.
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BepaH, H. H Byprep, M.: 14syveHHe oIITHManbHbix ycJioBH# ocaxapmBaHHH KapTO(IeJlbnbIx
saTOpoB nnecHeBb&MH aHaHMaTHgecHHMH upenapaTaMH . . . . . . . . . . . . . . . . 329
BJIaTTHIilfl, IX.: 3aMegaHxa no Bonpocy NHTep4epeHI~HH HITaMMOB Bupyca Ta6a'Ho t MOaaHRH 356
BJIaTTH1IL, IA., B KaK, H., J1xM epK, H. N o#HHHCiN#, B.: K Bonpocy anHAeMHOJIOrHH
cTOJl6ypa B TIC, B oco6euHOCTH cTOJI6yp a KapTO(1e3IH . . 181
BJIaniKOBH'i, R., BbiCTpur~KN#, B., CT1IH, B. x HOBapoBa, B.: H npo6aeMe (IHm-Tpyiou;HXCH
4)opM 6aHTepi# 8
BopeuKHR, JI.: H Bonpocy BHpYCHIIX peI[enTOpOB. 06 aJIeRTHBHO# cHneHBaeMOCT} apHTpo-
I;HTOB cycnnxa Citellus citellus . 344
Byprep, M. B BepaH, H.: H Bonpocy TpaHcrJII0 (08HANpyioiI[e# AeHTeJIhHOCTB aHBHMaTH-
HecHHX npenapaTOB Aspergillus niger . . 227
Byprep, M., Poxoc, M. H rlpoxaaxa, H.: BJIHHHHe X IOpTeTpaz;HKnHHa Ha alTHBHOCTE,
a-aMHJIaabl . . . . . . . . 320
BaBpa, 10.: Ref CTBHe cTpenTOMNUHHa Ha )KryTHKOBUx Euglena gracilis Klebs.. . . . . . 351
BHHTep, B.: Cnopoo6paaosaHne 6awmnn. HIeppexoA xanbu(H B KJIeTHH H naAeHHe npOTeoJIHTH-
*iecxo# aKTHBHOCTH cpeU I npH cnopoo6paaoBanrH Bacillus megatherium . . . . . . 216
Bo#THmIoBa, M.: H Bonpocy yYaCTHH HeonJIOAOTBOpHIOli Hx HcHBYHKOB B noJIOBOM n OIxecce 239
Bo#TMmicoBa, M. H HHH)Ke, B.: OTAaaenHOe nonoBOe cxpeuWWBaHHe >;ecapHH (Numida 84
meleagris 4) c neTyxoM (Gallus domesticus a) .
rameK, M.: BJiHHHHe BHyTpxaapoANmeBaIx BnpBICKHBaHN# 11y)KepoAHO# Rpm Ha o6paso- 48
BaHHe aHTHTen. II. IHccneAOBaHHH peaKTNBHOCTB y yToH, ryce# H IIecapoK
rameK, m., rpa6a, T. H 3CCJIOBa, M.: rIoAaBJIcHHe o6paaOBaHHH NMMyHHBIX arrJIIOTHHHHOB
Y I;binJHT, KOTOpBfl na nepBbi# Aenb noc 8e BBIKJIeBBIanBH BnpbICHHBaJIHCb `iy)KepOAHHe
8PHTpO1IHTb1 H JI(#KOUNTbi . . . 54
ramooBa, B. H IIOHOpHaH, 3.: BJINHHBe BHTpaaM6pBOHaJibHbix H MHOrOKpaTHHx nocT8M6pHO-
HaJIbHbix Bn HcxxaaHH# KpOBH Ha o6paao anHe reTepoarrmoTHHNHOB . . 249
re#TMaHen, M. H Fe#TMaHKOBa-YrpOBa, H.: Heo6binnbie 4opMH HaxeHKNBOCTH Tricho-
phyton mentagrophytes . . . . . . . . . . . . . . 149
repMBH, (D.: H Bonpocy MHHpOCTpyKTypbl H(HBoro BeigeCTBa . . . . . . . . . . . . . . .1
repmHK, (D.: MexanuaM 6HoiiorH9ecxoro Ae 1CTBHH o6Jly'ienBH . . . . . . . . . . . . . 193
Iropwaaxa, (D., BoyqKoBa-MapTHHoBcHaH, A. H CTe#cxaJi, B.: I oTOnepBoAH'iecxne onblTbl
c npocoM . . 88
rpa6a, T.: 14MMynoaora`iecxoe noBeAeHHe aM6pxonaabxbix napa6HOHTOB Me%Ay HHAOmBO#
H Kypxge# . . 165
rpa6a, T. H rauieK, M.: rOMOTpaucnnanTaI(HH xo2KH y oAHoAHeBHbIX IUbIniiBT, yTHT H HH-
AlomaT 61
rpa6a, T., raiueK, M. H LIyMnBBcitx#, B.: 14MMyHoJIorwlecxoe c6aH)KeHHe y oseVbe#
TpO#HH, eCTecTBeHHbIX aM6pxoHaJlbHIIx napa6HOHTOB . . . . . . . . 276
rpa6a, T., ramxoBa, B., JleHrepOBa, A. H Bo#TNmxoBa, M.: BJIHHHHe BHyTpBaapOAg-
nieBbix BnpaIcKHBaHH# 9yxtepOAHO# xposN Ha o6pasoBanHe aHTHTeii. I. I ccileAOBaHxn
peaHTHBHOCTH y Kyp 43
rp08AaHOBH9, H.: MMMyHOJiorH'iecI oe C6JIHmeHHe y KpaIC no OTHomeHNio K MbImHHO#
onyxonH Crocker-a B aM6pHoreHeae H nocTaM6pHoreHeae. . 296
r menb, 14.: 14cci1el oBaHBH MHTOxoHApBaJlbHbix o6paaoBaHN# y pHca H nmeoHui,I . . . . 371
gOCTa3Iex, M. H Cnypnbi#, M.: HyJibTHBauxoHHHe xapaRTepHcTHKH AecyJ1b~ypxpyi0ii KX
6aKTepxl Ha He(~THHhIx aaJie)Ke# . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338
ItoraHOBCKN#, 10.: COCTOHHHe HeBocnpHHM`ifBOCTH B TeneHHe axcnepHMeHTaJIbHO# cTa-
4)HnoKORRoBoU nHi esui4H . 141
Hapn(Deimb, 3.: XapaKTep Jle#xoUHTapno# peammii nociie peHTreuoBeHoro o6Jiy'eHHH 211
MHJIOBHAOB, rl.: OnpeAeJieHHe NcHBHeHHOCTH KOHNAH# CnOpNIHbH no McTOAy npu)KHaHeHHOrO
oxpamxnalHH 375
HepMyT, M. H Heqac, 0.: L-(opMbl 6aKTepH#. III. BnHHHxe KoiweHTpaiurn neHHAHJnJINHa
B epeAe Ha paaBiiTHe L-o6paaoBaBN# y Proteus vulgaris . 36
llevac, 0.: }I(Naxecnoco6HOCTb KJieTo*iHbiX l parMeHTOB Apo)KHte#. IV. CBHab Me H y HApoM
H cnoco6HOCTbio K poCTy . . . . . . . . 29
rlenxa, M.: Oi;eHKa notiBeHHO# BOAM c noMon{bio 6HOiiorHYecHoro McTOAa KpHBbix BLiCii-
xaHHH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
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HocimumJI, (D.: BJIHHHHe paAHOH30TOnoB SZb H P82 Ha HaMeHeHHfi 6HOnoTeHAHaJIOB KOpHH 112
IlpacJ1HYKa, M. H Iliiemxo, H.: BJIHHHHe cnnpTa Ha AetiCTBHe o6JIyxieHHfi y MbIIIIe t . . . . 121
Hyaa, A. H MoJlbnap, H.: HCCJIeAOBaHHH peaKTHBHOCTH Kpblcbl nocae BHyTpiaapoAblmeBb1X
BnphICKHBaHHA 9y}KepogHbIx HpoBHHbIX TeJleu . . . . . . . . . . . . . . . . 300
PoaeH6epr, M.: DaroJIHaHC KJIeTOK cTa(HJloxomia . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
PoaeH6epr, M.: AHHaMHHa pacnaAa JIH30reHHbIX KJIeTOK noA Ae#cTBHPM yJIbTpa()HoJIeTOBhIx
Jiyxieft . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206
Poacbinaii, H. H Mpaa, (D.: BaKTepnoabl CeaHHoro Maxa, Ha6JIIOAaBmHeCH B gexoCJlOBaKHH 233
PblmaBblfi, B.: H Bonpocy cnegH(HWIHOCTH H HBMeWIHBOCTH KOKIjHAHft y pa3JIHYHhIX XOBHeB 65
CaHTO, H.: THTppaIXHH BHpyca rpHnna B TKaHeBblX KyJlbTypax . . . . . . . . . . . . . 79
CB06OAa, H. H ItdmeK, M.: BoaAeftCTBHe HMMynoJloraxiecxoro c6JIH]HeHHH Ha nepeAaBaeMOCTb
BHpyca capxoMbi Rous-a y HHAeeK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
CKaJIHa, M.: BJIHHHHe HOTepH HpOBH Ha CMepTHOCTb Mblmeft OT peHTreHOBCKOrO 06JIy'ieHHH 116
COCHOBa, B.: AHaTOMH'IeCHO-IIHTOJIOrH'ieCKHe HccJIeAOBaHHH nJIaCTHAOB B TOj3KaX pOCTa 364
TOHHH, B. H.: HaygHoe HacJiegHe H. H. MegHHKOBa H BonpOCbl HMMyHHTeTa aM6pHOHOB 261
TpHKa, 3.: BJIHHHHe HeAOCTaTKa H Hs6blTKa 6eJIKOB B nHH(e Ha HMMyHHyIO peaHi(Hio . . 306
XaJIoynKa, 10.: rlpOTeoniTHYecKIie aHaHMbt airHHoMHIIeTa Streptomyces grlseus. II. BJIHH-
HHe xappanTe a H KOHAeHTpaIIHH a30Ta Ha BbIJ{eJfeHHe npOTeaahI . . 72
XyTHaH, PI.: Hay'IeHHe aaacuBJIeHHH paHbl B AenepBHpoBaHHoft KoReIIHOCTH . . . . . . . 157
XyTHaH, H.: K Bonpocy MexaHHaMa AecTpyRIuHH roMOTpancnJlaHTaTOB. I. CpaBHHTeJlbnoe
rncToJlorHYecxoe HayveHHe aBTO-, roMO- H reTepoTpaHCnJIaHTaTOB . . . . . 284
11ITepAJlb, H.: AJIHTeJIbHaH HMMyHHaal[HH. HaienenHH B o6paaosaHHH allTHTeil, B JiefiKO-
I HTapHoft H TeMnepaTypHOfttpeaHAKH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
IIITepI;Jib, H. H rpy6em0Ba, M.: Hepexoc cnoco6HOCTH K o6paaoBaHHIo alTHTeJI Ha He-
HMMYHH3HpOBaHHbiX peLUHnHeHTOB HyKJIeonpoTeuAHbIMH 4paKgHHMH . . . . 21
3prapAosa, B. H PblmaBblft, B.: K Bonpocy HBaHTHTaTHBHhIX Konponori'Iecxnx McTOAoB
HCCJIeAOBaHHH B reJIbrHHTOJIorHH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
Apnau, H. it HHOTKOSa, 0.: K npo6JleMaTHKe 6aKTepnanbnoro MnxoJIHaa . . . . . . . . 191
Pamei, M., Jleareposa, A., Maftep, H. H MaTepaosa, 3.: H Bonpocy porn KJIeTOH B IIpO-
uecce c6JinmenHH 124
Bep9HK, (D.: HepeAaIOMHficu JIHanc KJIeTOH Escherichia coli, BblahIBaeMbift peHTrenoBcHHM
o6JIy4eaneM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 380
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BlattnSr, C., Brit6k, J., Limberk, J., Bojdanskk, V.: Beitrag zur Stolbur-Epidemiologie in der 10SR
. . . . . . . . . . . . . . .
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Burger, M., Rokos, J., Proch&zka, P.: Effect of Chlortetracycline on the Activity of a-amylase . . 320
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. . . . . . . . . . . . . .
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Hraba, T., Ha&ek, M.: Skin Homotransplants in Day-old Chicks, Ducks and Turkeys 81
Hraba, T., Ha&ek, M., c,umlinskf,, B.: Immunological Approximation of Sheep Triplets, Natural
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FOLIA BIOLOGICA
Study of Optimal Conditions for the Saccharification of
Potato Mashes by Mould Enzyme Preparations
K. BERAN and M. BURGER
Institute of Biology, Czechoslovak Academy of Science, Department of Microbiology, Praha
A great number of authors have contributed to the study of the problem of using
amylolytic preparations of moulds for the saccharification of starch material for the
alcoholic fermentation industry. The results of all these papers show that these
preparations can successfully replace malt which has been used up to now. The great
majority of authors used various cereals as the basic starch material. With regard
to potatoes, however, there is insufficient material for comparison.
Interest has been concentrated mainly on two kinds of mould: Aspergillus niger
and Aspergillus oryzae. Preparations from these moulds are made both on solid
substrates, particularly bran (Roberts et al. 1944, Takamine 1914, Underkofier et al.
1939, 1946, Lu-Cheng Hao et al. 1943), and on liquids by submerged culture. A. niger
is mostly used for submerged culture (Le Mense et al. 1949, Adams et al. 1947,
Teixeira et al. 1950).
The temperature at which starch material is saccharified varies. With A. oryzae,
50-55? C is most often cited (Underkofler et al. 1939, Lu-Cheng Hao et al. 1943,
Roberts et al. 1944), although 30? C is also given (Lu Cheng Hao et al. 1943, Roberts
et al. 1944). With A. niger the same or a somewhat higher temperature (60-62? C)
is cited (Le Mense et al. 1949, Adams et al. 1947).
These higher temperatures do not, however, correspond in character to saccharify-
ing temperatures as we understand them in technological processes (Underkofler
et al. 1946, Adams et al. 1947, Teixeira et al. 1950). During saccharification the pH
of both preparations is usually kept at the same value of about 5.5.
In a recent paper (Burger and Beran 1956) we have shown the great effect of
temperature on maltase activity during starch hydrolysis by the enzyme preparation
from the mould, A. niger. Maltase activity was 7.3 times greater at 65? C than
at 30? C. For these reasons we decided to verify-the optimal conditions of temperature
and pH for the saccharification of potato mashes by mould preparations.
Enzyme Preparations and Material
Enzyme preparations from two kinds of moulds, Aspergillus niger and Aspergillus oryzae, and dried
diastatic malt were used in the experiments. The moulds were cultured on bran. The methods of culturing
the moulds and of making the enzyme preparations have been described previously (Burger and Beran
1954, 1956). As distinct from the papers mentioned the mould enzyme extracts were filtered through
a sintred glass crucible (G4). Potato flakes containing 65.58 % starch or soluble starch p. a. (Lachema)
were used for the preparation of the mash.
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Fermentable sugars (glucose, maltose and maltotriose) were determined by the method already
described (Beran and Burger 1955). The method is based on the technique of fermenting samples by the yeast,
Saccharomyces cerevisiae R XII, in the presence of 2,4-dinitrophenol, the amount of fermented sugar being
calculated from the volume of carbon dioxide formed on the basis of Gay-Lussac's stechiometric relation.
The amount of fermentable sugars determined is expressed as glucose. Chromatographic analysis of
sugars was made by a modification of the method described by Green and Stone (1952). The dextrination
activity was determined by a modification of Wohlgemuth's method (Belozersky and Proskuryakov
1951); the iodine test was performed with iodine solution, using the volume of samples given in the
description of the method.
Potato mashes prepared from potato flakes with a final starch content of 5 and 10 % were used for
the experiments (see below). The necessary amount of finely ground potato flakes was weighed into
test-tubes, 3 cm. in diameter, then water was added in amounts necessary to bring the final volume
of mash up to 25 ml. after the addition of the enzyme extract of the mould. The potato meal having been
mixed with water, the test-tubes with their contents were autoclaved for half-an-hour at 1/.y atm. After
autoclaving, the test-tubes were kept in a water bath at 50 ?C.
When studying the effect of pH on the dextrination activity of mould preparations, the same volume
of a 15 % solution of soluble starch was used. With the A. niger preparation, the range of pH under
consideration (3.5-6.5) was obtained by acetate buffer at a final concentration of 0.1 M; with A. oryzae
(7.6-4.6) by veronal-acetate buffer at a final concentration of 0.02 M.
To the substrates thus prepared, quantities of enzyme extract were added so that the weight of dry
mould preparation used amounted to 10 % of the weight of starch present in the experiment. Exceptions
to this proportion are given in the description of the experiments in question.
Test-tubes with substrates were placed in a water bath. The effect of temperature in the range of
25-80 ?C was studied. If not stated otherwise,
saccharification time was one hour. After that
d b
u enzyme process was stoppe
y
dipping the test-tubes into a boiling bath and
the necessary analyses were made after allowing
them to cool off.
Formation of Fermentable Substances
during Saccharification of Potato
Mashes with a 5% Starch Content
Fig. 1. Effect of temperature on formation of fer-
mentable substances during saccharification of
potato mashes with 5% starch content. y: mg. of
fermentable substances expressed as glucose in 2.5
ml. sample, x: temperature in ?C. Curve 1 A.
oryzae, 2 - A. niger.
ces formed during saccharification of
potato mash with a 5% starch content
was studied at temperatures ranging
from 25-65? C. The amount of dry
enzyme preparations used was 15%
starch weight. The results of the ex-
periments are given in figs. 1 and 2.
As shown in fig. 1, the temperature optimum for the formation of fermentable
substances during saccharification of potato mash by the A. oryzae preparation lies
between 50 and 60? C, and, in the case of the A. niger preparation the temperature
of 65? C was not exceeded. The flatness of the curves may be explained by the large
content of enzymes and the lack of substrate in the system.
The saccharification test by iodine solution showed that the achroous point was
reached in the A. oryzae preparation at a temperature as low as 40? C, and in the
A. niger preparation at a temperature as high as 65? C. Before reaching this tempera-
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ture the A. niger preparation gave the whole series of colours, characteristic for the
degree of starch hydrolysis, from violet at 25? C up to achroous at the temperature
of 65? C.
Fig. 2 gives chromatograms of mashes after saccharification by A. niger, A. oryzae
preparations and malt at temperatures of 25, 47, 57 and 65 T. Perceptible variations
in the decomposition of individual sugars are due to the different enzyme composition
of individual preparations as shown previously (Feniksova 1953, Klimovsky and
Rodzevich 1950, Burger and Beran 1954, Starka 1954). Chromatograms of mashes
Fig. 3. A. oryzae Fig. 4. A. niger.
Effect of temperature on formation of fermentable substances during saccharification of potato
mashes by mould preparations (10% starch content in mash).
x: temperature in ?C. y: mg. of fermentable substances expressed as glucose in 2.5 ml. sample.
Curve 1 - saccharified for 60 minutes, 2-40 minutes, 3-20 minutes.
Fig. 5. A. niger Fig. 6. A. oryzae
Fig. 5, 6. Course of formation of fermentable substances during saccharification of potato mashes by
mould preparations at various temperatures (10% starch content in mash).
x: time of saccharification in minutes. y: mg. of fermentable substances expressed as glucose
in 2.5 ml. sample.
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saccharified by the A. niger preparation show clearly a large amount of isomaltose
produced by transglucosidation and a quantity of maltotriose decreasing with
increasing temperature.
Chromatographic analysis of products formed during saccharification of potato mashes contain-
ing 5% starch. Course of formation of products formed during saccharification of potato mashes by
mould preparations under optimum temperatures (A. niger 65 ?C, A. oryzae 55 ?C).
M
!M
M3
A. niger Malt
Fig. 2.
20' 40' 60' 20' 40' 60' MN SI
A. niger A. oryzae
Fig. 7.
F - fructose, G - glucose, M - maltose, IM - isomaltose, M3 - maltotriose, P - panose, M4 - malto-
tetraose, M5 - maltopentaose, MN - maltose incubated with A. niger preparation with simultaneous
fermentation by the yeast S. cerevisiae R XII, Sl - maltose after incubation with A. niger preparation,
S2 - malt extract.
Formation of Fermentable Substances during Saccharification of Potato Mashes
with a 10% Starch Content
Since there was an insufficiency of substrate in the above experiment it was
repeated on a mash containing 10% starch and with a smaller amount of enzyme
preparation (10% of starch weight). The temperature range studied was narrowed
to 50-80? C in the case of the A. niger preparation and 50-60? C with the A. oryzae
preparation. At the same time, the amount of fermentable sugars formed at these
temperatures after 20, 40 and 60 minutes of saccarification was studied. The results
of this experiments are given in figs. 3, 4, 5, 6 and 7.
As shown in figs. 3 and 4, the A. niger and A. oryzae preparations differ in their
optimum temperature. After 60 minutes of saccharification, the optimum tempera-
ture of the A. oryzae preparation was 55? C and that of the A. niger preparation
was 65? C. At these temperatures 46.6% of fermentable substances in relation to the
amount of starch present is produced with A. oryzae and 56.1% with A. niger.
Figs. 5 and 6 give the amount of fermentable substances in time relation. The linear
course of the curves up to 65 ?C with the A. niger preparation and up to 55? C with
the A. oryzae shows clearly that a distinct inactivation of enzymes appears only above
these optimal temperatures.
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Saccharification tests with iodine solution showed that with the A. oryzae prepara-
tion the achroous point was reached after 60 minutes of saccharification at all
temperatures investigated, but that a yellow-brown colouration only was obtained
after 40 and 20 minutes of saccharification. A yellow-brown colouration was obtained
with the A. niger preparation only at the temperature of 65? C after 60 minutes
of saccharification. At that temperature the colouration was a bright red after
40 minutes of saccharification and red-brown after 20 minutes. This colouration
of samples was the lightest in the whole series of temperatures and times studied.
In the other cases the colouration of samples by iodine has shown various degrees
of starch decomposition.
Fig. 7 shows chromatograms of mashes saccharified at optimal temperatures
(A. niger 65? C, A. oryzae 55? C) after 20, 40 and 60 minutes of saccharification.
Mashes saccharified by the A. niger preparation show a considerable production
of isomaltose formed by transglucosidation; the amount of isomaltose increases
with time: next there is a considerable amount of maltotriose, but a small quantity
of panose and maltotetraose. Chromatograms of mashes saccharified by the A. oryzae
preparation show sugar decomposition characteristic for a-amylase activity, i. e. small
quantities of monosaccharides and large quantities of oligosaccharides and higher
components. These higher components decrease with time. Chromatograms of malt
extract and maltose incubated with the A. niger enzyme preparation are given
as standards since their distribution of sugars in chromatography is well-known.
The chromatogram of maltose incubated
with the A. niger preparation after
fermentation with the yeast S. cerevisiae 40
R XII, without stopping the enzyme
activity of the preparation, shows that
not only maltotriose but also isomaltose
and in part panose are broken down as 30
well. This confirms our previous find-
ings (Burger and Beran 1954).
Effect of pH on Starch Dextrination 20'
Various quantities of enzyme pre-
parations were used in this experi-
ment. The A. niger preparation was
40 50 5070
added in amounts of 10 % of the weight
of starch present and A. oryzae in Fig. 8. Effect of pH on dextrination activity of
amounts of 5.6%. We worked at the starch. x: pH values. y: a-amylase units. Curve optimal temperatures given above. The 1 - A. oryzae, 2 - A. niger.
results are given in fig. 8.
As shown in fig. 8, the enzyme preparations of A. oryzae and A. niger also differ
in their optimal pH value for starch dextrination. The optimal pH found was 4.5 with
the A. niger preparation and 6.1 with A. oryzae. The course of the curve shows
dextrination activity of A. niger preparation to be only slightly affected by low
pH values, as opposed to this the dextrination activity of the A. oryzae preparation
is considerably affected.
Formation of Fermentable Substances in Unbuffered 10% Starch Solution
The formation of fermentable substances appearing during starch hydrolysis by
malt and the preparations of A. niger and A. oryzae was studied. The 10% solution
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of soluble starch was not buffered. Saccharification time was 30 minutes. The results
are given in fig. 9.
During incubation considerable acidification of the substrate occurred. In the
experiment with malt pH decreased to 3.2, with the A. niger preparation to 3.5 and
with A. oryzae to 5.0. It can be seen that this decrease in pH had a negative effect
on the formation of fermentable sub-
stances, especially in the case of malt.
ThA fnrma.tinn of fPrmvnt,A.h1P anh-
stances was also affected in the case
of the A. oryzae preparation, but not
in the A. niger preparation. This
corroborates the results of the pre-
vious experiment. Since saccharificat-
25 x- ? 2 ion lasted only half-an-hour, it is clear
that the optimal temperatures tend
o Various authors use various sac-
J0 50 00 charification temperatures for the
saccharification of starch material by
-- - ..... r.vaa.~uaV Vaa aVa11aZ4 U1V11 Vl ltll-
mentable substances during 5% unbuffered hydrolysis mould preparations. These tempera-
of soluble starch (time of saccharification 30 minutes). tures vary between 30? and 55? C
x: temperature in ?C. y: mg. of fermentable substances when A. oryzae is used and between
expressed as glucose in 2.5 ml. sample. Curve 1 - A. 50? and 62? C in the case of A. niger.
oryzae, 2 - A. niger. We have not found any systematic
study in the literature available
devoted to the problem of optimal temperatures in the saccharification of starch
substances by mould preparations under conditions of technological processes.
Saccharification temperatures used up to now seem, therefore, to be the result of
chance discoveries or in analogy with the use of malt.
In our work, of a theoretical nature, studying the effect of temperature on the
activity of enzyme systems during starch hydrolysis by preparations of A. niger and
A. oryzae we have shown the great effect of temperature in the activation of maltase
of A. niger (Burger and Beran 1956). The validity of the established optimal tempera-
tures during the hydrolysis of a 10% solution of soluble starch after 60 minutes of
saccharification (A. niger 65? C, A. oryzae 55? C) has also been confirmed on potato
flake mashes. At these optimal temperatures no evident inactivation of enzymes
occurs. As iodine tests show, these temperatures are also in accordance with the
optima for dextrination activity of the preparations used.
Optimal conditions for hydrolytic activity of preparations of the moulds A. niger
and A. oryzae differ not only in optimal temperatures, but also in a different optimal
pH and in the effect of changes in pH on their dextrination activity. The optimum pH
for starch dextrination by the A. oryzae preparation is 6.1; when pH changes,
particularly which in decreases, activity falls considerably. The behaviour of an
enzyme preparation of A. oryzae is, therefore, similar to that of malt, the saccharifica-
tion power which had completely disappeared when pH fell to 3.2, with increasing
the temperature to above 55? C, when the temperature also inactivates (3-amylase.
These findings are in accordance with the well-known fact of the sensitivity of
a-amylase to lower values of pH. For this reason mashes prepared with malt cannot
be acidified. Optimum pH for starch dextrination is 4.5 with the A. niger preparation
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and corresponds therefore to the optimum pH for the activity of mould maltase.
This is in accord with our previous findings (Burger and Beran 1956), that in A. niger
preparations maltase causes hydrolysis of the whole starch molecule in isolation
from cc-amylase. Fairly wide changes in pH, too, only have a slight effect on
activity. This behaviour of A. niger preparations is probably connected with the
physiological properties of the A. niger mould which is also capable of producing
considerable amounts of acid. The possibility of using a lower pH during saccharifica-
tion of potato mashes is of great importance for agricultural distilleries. It makes
a considerable acidification of mashes during saccharification of starchy material
possible and the conjoined effect of low pH and relatively high saccharification
temperature must be evident in the microbiological purity of the mashes. Even during
fermentation a pH of 4.5 affects the course of fermentation favourably and prevents
the proliferation of undesirable infection.
Summary
The effect of temperature on the formation of fermentable sugars and the effect
of pH on dextrination activity during starch and potato mash hydrolysis by enzyme
preparations of the moulds, Aspergillus niger and Aspergillus oryzae (mould bran),
were studied. The following facts were ascertained:
1. When studying the effect of temperature on the formation of fermentable sugars
in saccharified potato mashes (time of saccharification 60 minutes), different optimal
temperatures of effectiveness were found for each preparation: A. niger 65? C and
A. oryzae 55? C.
2. At these temperatures 46.6% of fermentable substances in proportion to the
starch present were found in the case of the A. oryzae preparation, 56.1% in the
A. niger preparation.
3. Optimum saccharification temperature is also in accord with optimum dextrina-
tion activity.
4. The optimum pH for starch dextrination by A. oryzae preparations is 6.1%;
changes in pH (especially a decrease) considerably lower dextrination.
5. The optimum pH for starch dextrination by the A. niger preparation is 4.5;
changes in pH effect it only slightly.
6. The importance of low pH and relatively high temperature during saccharifica-
tion of starchy material by the A. niger preparation for practical distilling has been
ascertained.
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3ainio, TaH H AeHCTpI1HOJ1I13. Mm lOKa3aJIH TaK?Ke, HaH BeJIHKO BJIHHHHe TeMnepa-
Typbl Ha BHTBBHOCTb MaJITa3bI. B HacTOHnjeI1 pa60Te mm HCcJIeAOBajIH OHTHMaJIbHIIe
yCaOBHH (TeMnepazypy n pH) AJIH AeaTeJlbnocTH 3THX npenapaTOB npn ocaxapn-
BaHnn HapTo(eJlbnblx 3aTOpoB, allajiorngHbix npHMeHHeMbIM B npOHBOJjcTBe. Coj(ep-
xcanne HpaxMaaia B 3aTOpax Aoxo)lnnlo go 10%. OAHOBpeMeuHo Mbl H3y'IaJil3 01ITH-
MaJIbHble yCJIOBHH ocaxapnBannx KapTO(JeJlbnbIx 3aTOpOB y ii ieCHeBbix npenapaTOB
H3 Aspergillus oryzae, co;tepxcaBIIII3x n3 aMgJioJ1HTHgecx14x 3H3HMOB npexMyuxe-
CTBeHHO a-aMnna3y. Mbl HcOJIeAoBaJin TaK?Ke npoiecc o6pa30naHHH Hec6paHCH-
BaeMbIX OJInrocaxapaAOB npn ocaxapHBaHnn KapTO(ennbHbIx 3aTOpoB. BbIJIO ycTanoB-
JIeHo, 'ITO:
1. Pa3Jingne MexcAy npenapaTaMa A. niger H A. oryzae B oTHOIneHHH o6pa30BaHHH
c6pa?KHBaeMblx caxapoB npn 60-MIIHyTHOM ocaxapnsaHl3H KapT0[ 0JIbnbIx 3aTOpOB
npo$IBJIfOTC1 B nX O]1THMaJ1bHb1X TeMnepaTypax (Ana A. niger 65? C, AJia A. ory-
zae 55? C).
2. HOA AegcTBneM npenapaTa A. oryzae np11 3THX TeMilepaTypax o6pa3oBaJIocb
46,6% c6paxcIBaeMblx B3IA3CTB, a noA AOi CTBneM npenapaTa A. niger, coOTBOT-
cTBeHHo, 56,1% B nepecgeTe Ha npncyTCTByion;Hil Hpax amm.
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3. OIITHMam6HbmM TeMIIepaTypaM COOTBeTCTByeT OIITHManhHOC AeKCTpHHHpyIOIIjee
J(eiiCTBHe.
4. gan ocaxapIIBaHHfi KpaxMaJla IIpenapaTOM A. oryzae OIITHMaJIbHbIM RBJIHeTCH
pH = 6,1, IIpHqeM KOJIe6aHHH pH, B oco6eHHOCTH B CTOpOHy IIosbimeHHH iIICJIOT-
HOCTH, BLI3bIBaeT 3HaLIHTeJIbHOe IIOHHH{eHHe ReKCTplHH3auHH.
5. ,JIH ocaxapHBaHHfi xpaxMana npenapaToM A. niger onTHMaJImHwIM flBJIHeTCR
pH = 4,5, IIpHLIeM KOJIe6aHHfI pH OKa3!IBaIOT Ha j(exCTpHHH3aqHIO JIHIIIb He3HaYH-
TeJIbHOC BJIH}IHHe.
6. 06cy7cuaeTCH BOnpOC 0 3HageHHH HH3xoro pH II CpaBHHTeJTbHO BNICOKOH TeMIIe-
paTypbi upi ocaxapnsaHHH cogep)KamHx xpaxMaJi MaTepnaJloB IIpenapaTOm A. niger
B npaiTHxe_ cnnpTOxypeHHoii npoMblIIIJTennocTH.
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FOLIA BIOLOGICA
Cultivation Characteristics of Sulphate-reducing Bacteria
M. DOSTALEK and M. SPURNY
Institute of Oil Research, Biochemistry Department, Brno
Sulphate-reducing bacteria may be regarded as one of the most important groups
of micro-organisms present in oil deposits. It has been demonstrated that a low
sulphate content and the occurrence of hydrogen sulphide in typical samples of oil
field waters is associated with activity of bacteria of the genus Desulfovibrio (Ginz-
burg-Karagieeva 1926, 1933, Bastin 1926, Bastin and Grer 1930, Ginter 1930). Many
authors found that these bacteria act on oil hydrocarbons and some are of the opinion
that the differences in the character of oil found at varying depths in the same area
are connected with the activity of this physiological group of micro-organisms
(Uspensky, Gorskaya and Karpova 1947, Tauson, Aleshina 1932, Novelli, Zo-
Bell 1944, ZoBell 1950). An important role is also ascribed to sulphate-reducing
bacteria in the genesis of oil (Porfiryev 1948, Radchenko 1951, Jankowski and
ZoBell 1944) and in the releasing of oil from oil bearing materials (ZoBell 1947).
The present paper sums up the results of experiments for investigating methods of
culturing sulphate-reducing bacteria from oil deposits under laboratory conditions.
The following nutrient medium was used for accumulating sulphate-reducing bacteria from samples
of water from oil wells and for further cultivation: K2HPO4 0.1%, NH4C1 0.1%, CaC12 0.01%, MgCl2
0.01%, Na2SO4 0.1%, Na2SO3 0.02%, ammonium lactate 70%, 0.5 ml./100 ml. nutrient medium,
yeast extract 10 mg./100 ml. medium. The initial pH of the solution was adjusted to 7.0, the oxidation
reduction potential to Eh values of about + 50 mV. Traces of iron were added to the medium to determine
the duration of the lag phase. The cultures were incubated in 50 ml. reagent bottles with glass stoppers.
The inocula were taken from a three-clay culture of sulphate-reducing bacteria. The inoculum formed
0.5% of the volume of the inoculated medium; 1 ml. of inoculum contained 107 bacteria. Incubation
took place at a temperature of 32 ?C, as a rule for six days. The number of bacteria was determined
microscopically; these results were verified by comparing with a determination of the number of bacteria
ascertained by the dilution method in a nutrient medium containing ammonium lactate. The hydrogen
sulphide content of the cultures was determined polarographically, by measuring the anode waves
in a medium of 0.1 N NaOH (Hemala, Marek, Valcikova 1955).
In order to obtain sufficient material for testing cultivation conditions, sulphate-reducing bacteria
were collected from 89 samples of water from oil wells in six different areas. After the fourth progressive
re-inoculation of these cultures, the duration of the lag phase attained a certain value, which did not
change on further culturing. The largest group contained cultures with a lag phase of about 18 hours
and it was from this group that cultures were taken for further experimental work. The microscopic picture
of this culture showed typical vibrio forms (figs. 1 and 2). On testing the purity of the culture on meat-
peptone agar it was found that bacteria of the genus Desulfovibrio were accompained in the culture
by Gram negative sporulating bacteria and Gram positive cocci (figs. 3 and 4). Both accompanying
micro-organisms occurred regularly in cultures of sulphate-reducing bacteria on progressive re-inocula-
tion and their concentration was about two orders lower than that of the Desulfovibrio bacteria. From
the physiological aspect, this mixed culture displayed stable properties under standard conditions of
cultivation (length of lag phase, reduction of sulphates, production of hydrogen sulphide).
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In order to the influence of the initial pH and Eh, a nutrient medium containing
lactate was used. When studying the influence of the initial pH, the oxidation-
reduction potential of the medium was not modified (Eh + 350 mV at pH 7) and
when studying the influence of the oxidation-reduction potential, the initial pH 7
was maintained. Each experimental series
was repeated three times. The results are I!
shown in fig. 5 and tab. 1. His
When studying the influence of growth
substa.nces_ a condensed yeast extract of m9/11
1501
not given). After sterilising, a 1 % solution
of the extract was added to a medium 30 20
containing lactate. Each experimental 120
series was repeated four times. The results
are given in tab. 2. The concentrations Fig. 5. Influence of initial pH on development
of yeast extract are expressed in mg. dry of sulphate-reducing bacteria. Curve I: Pro-
weight/100 ml. nutrient solution. duction of hydrogen sulphide (mg./1) after 6
For ascertaining the influence of the days. Curve II: Length of lag-phase in hours.
concentration of sulphates on the develop-
ment of sulphate-reducing bacteria, a
nutrient solution containing lactate was Table 2. Influence of Yeast Extract
used, with graduated amounts of sodium
Yeast Length of Amount of H2S
sulphate. The results are given in fig. 6.
extract lag phase after 6 days
Table 1. Influence of Initial Eh mg./100 ml. in hrs. in mg./l.
Initial
E
h
Length of
lag phase
in hrs.
Amount of H2S
after 6 days
in mg./l.
+ 350
36
149.5 ? 3.5
x-202
24
151.5?3.1
+ 110
24
165.2 t 3.1
0
18
167.2 ? 2.8
- 22
18
168.3 ? 3.2
- 40
18
165.2 + 3.2
- 60
24
165.3 f 2.9
- 101
24
163.2 3.6
0
48
150.4 ? 3.5
0.2
48
149.2 ? 4.2
0.5
48
146.4?3.8
1
24
155.1 ? 3.9
3
24
158.1 4.2
5
18
195.0 ? 5.2
10
18
182.2 f 4.2
15
18
179.0 ? 4.2
20
18
170.3 f 3.8
25
18
170.5 3.9
30
18
171.2 ? 2.3
50
18
172.1 ? 4.2
100
18
174.2 ? 3.2
For ascertaining possibilities of evaluating the intensity of the development of
sulphate-reducing bacteria, the following growth characteristics were studied in the
course of cultivation: 1. The number of bacteria, 2. the amount of hydrogen sulphide
produced, 3. changes in the oxidation-reduction potential. The nutrient solution
with lactate which was used for these experiments had a pH of 7 and Eh of +48 mV.
Five parallel cultures were observed. The results are shown in fig. 7.
In another experiment the influence of the age of a culture used as an inoculum
on the development of sulphate-reducing bacteria was ascertained. The length of the
lag phase of the inoculated culture was used as the criterion. In order to obtain
values for comparison, 60 cultures of sulphate-reducing bacteria were inoculated
simultaneously and incubated at 32? C in a thermostat. At selected time intervals,
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sets of four cultures were removed and from these 16 culture bottles containing
a medium of the same composition as the solution used for pre-cultivation were
inoculated. The results of the experiment are given in tab. 3.
1 300
,200
fao0
"0
4001
350
00
50250 _,
a ~ 200
io 150
0
000
50
0,0001 00005 0,001 0005 0,01 . 0,05 Q1
00002 0002 0,02
Fig. 6. Influence of concentration of sulphate in Fig. 7. Growth characteristics of sulphate-reduc-
medium. x: log of concentration of Na2SO4. 10 H2O ing bacteria. x: No. of days. Curve I: Product-
M in medium. Curve I: Length of lag phase ion of hydrogen sulphide in mg./l. Curve II: No.
in hours. Curve II: Production of hydrogen of bacteria in 108. Curve III: Oxidation-reduction
sulphide (mg./l.) after 6 days. Curve III: % potential (mV with pH 7).
sulphate utilisation.
Discussion and Summary
A culture of sulphate-reducing bacteria isolated from oil field waters was used.
In this culture, bacteria of the genus Desulfovibrio were accompanied by microflora
not identified in detail. Cultures of this character were obtained by analysing the
majority of samples from oil deposits. On progressive reinoculation, these mixed
cultures maintained constant physiological properties. On the basis of these findings
it appears probable that a certain physiologi-
Table 3. Influence of Age of Culture cal relationship exists between sulphate-re-
ducing bacteria and the accompanying micro-
Age of pre-cult. Length of lag phase flora. In view of the fact that the action of
culture in days of mixed cultures of sulphate-reducing bacteria
inoculated culture under natural conditions (water in oil wells)
must also be taken into account, no attempt
2 20 hrs. was made to obtain pure cultures for these
3 24 hrs. experiments. The intensity of development
4 30 hrs.
of the culture was evaluated by measuring
5 36 hrs.
.
6 38 hrs the production of hydrogen sulphide and by
7 38 hrs.
determining the length of the lag phase.
10 5 days
Both methods of evaluation were in accord
12 8 days
with each other (figs. 5 and 6).
16 13 days
In studying the influence of the initial
pH on the development of sulphate-reduc-
ing bacteria from oil deposits, the optimum was found to be within the limits
of pH 7 to 8 (fig. 5). The initial oxidation-reduction potential did not have any
significant influence on the final amount of hydrogen sulphide produced, but had
a marked effect on the length of the lag phase of the culture. The optimal medium
proved to be one with a value of Eh within the limits of 0 to -40 mV at a pH of 7
(see tab. 1). In accord with the data of other authors (Starka 1951), these experiments
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show that only a small decrease in the oxidation-reduction potential of the medium
is required for good development of sulphate-reducing bacteria (approx. below
+ 150 mV at a pH of 7). The addition of yeast extract had a favourable effect.
Discernible stimulation occurred at concentrations of 3-10 mg. extract in 100 ml.
nutrient solution. It is difficult to compare this result with those described in the
literature (Imshenetsky 1949, Starkey 1948), as these communications do not contain
detailed information on the preparation of the yeast extract.
A study of the influence of the concentration of sulphate in the nutrient medium
showed that with an increase in the concentration of sulphate there was also an
increase in the total amount of hydrogen sulphide produced (fig. 6). A very low con-
centration of sulphate (0.0001 to 0.001 M) permits development of sulphate-reducing
bacteria, but the growth curve of the culture in this medium shows a relatively long
lag phase. Within the limits of these concentrations, the sulphate is more or less
quantitatively reduced to hydrogen sulphide. As the concentration of sulphate
increases, the percentage of utilization progressively decreases. This decrease is
particularly evident in concentrations higher than 0.05 M. On the basis of these
findings, the optimal nutrient medium may be considered to be one which contains
0.005 to 0.02 M of Na2SO4. 10 H2O (0.07 to 0.28% Na2SO4 anhydrous).
The results of observation of the growth characteristics of the culture showed that
all the criteria used are suitable for ascertaining growth curves. In the curves showing
the production of hydrogen sulphide and the number of bacteria, there is a marked
lag phase lasting for approximately one day. This is not seen in the curve giving the
oxidation-reduction potential of the medium. It may be assumed from this result
that in the lag phase of proliferation of the bacteria the oxidation reduction-potential
is regulated. At the commencement of the logarithmic phase of proliferation of the
bacteria and of the production of hydrogen sulphide, the oxidation-reduction potential
attains a value of approximately Eh -40 mat a pH of 7. This value is in accord with
the optimal initial values of the oxidation-reduction potential found in previous
experiments . (see tab. 1). Under the given conditions the logarithmic phase lasts
approximately up to the end of the fourth day of cultivation and the stationary
phase up to the eighth day.
In the last series of experiments the influence of the length of pre-cultivation
on activity of the inoculum was evaluated. It was found that a 2- to 3-day-old
culture was the most satisfactory as an inoculum. In pre-cultivation longer than
10 days, the lag phase of the inoculated culture occupies a considerable time, its
length varies greatly and the culture is thus unreliable for use in inoculating further
cultures. The purpose of this work was to pave the way for a further, more detailed
study of sulphate-reducing bacteria in oil deposits.
(Plates XXXVII, XXXVIII)
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193Bej(eH H3 89 o6pa3I(OB He()THHbIX BO)(, B31ThIX H3 6 He()TeHOCHbIX o6nacTeI3. Ann
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BHSx HpogonxcaJlacb 18-24 iIaca, 4la3a JlorapH(HMHqecxoro pocTa 48-72 naca,
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KpIIBOII II3MeHeHHIi OKHCJIHTeJlbHO-BOCCTaHoBHTeJIJHoro IIOTeHI[HaJIa JIaTeHTHafI4 am
He OTpaH4aJLacb. OTcIo a HanpaHlHBaeTCH BhIBOA, 'qTO B TelIeHIIe JIaTeHTHOi3 4T)a3bl pa3-
MHO?KeHHfi 6aHTepHI3 peryJIHpyeTCfI OKHCJI14TeJIbHO-BOccTaHoBHTeJIbHbU1i IIoTeHI[HaJI.
OIITIIMaJIbHaa IIpOAOJUKHTeJIbHOCTb IIpeABaPIITeJIbHOH KyJIbTHBaIUHH IIepeA JjaJIbHeH-
IIIHMH IIepeCeBaMH 3T0 48-72 Llaca. Hpi 60Jiee IIpOAOJIMHTeJIbHOII, meM 10-AHeBHog
IIpeABapIITeJIbHOE KYJIbTHBaI;HH JIaTeHTHaI 4 a3a KyJlbTypm uoc iie IIepecoBa paCTFIrH-
BaJIaCb Ha CJIHIIIKOM AJIIITeJIbHble CpOKH, T. e. KyJIbTypa CTaHOBIIJIaCb HeiipHroAHOH
AJIii AaJIbHeA11aHx IIepeceBOB. HpOH3BeAeHHUIe HaMH pa60TM CJIymaT IIOAI'OTOBKOH
AJIfI AaJihHeiJmero, 6OJIee HoApo6Horo H3yHeHHH AecyJlb(ypHpyloigiax 6aKTepHA
He(T$IHMX 3aiie?Keg.
(Ta6.a. XXXVII, XXXVIII)
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FOLIA BIOLOGICA
On the Question of Virus Receptors
The Selective Agglutinability of Erythrocytes of the Ground Squirrel
(Citellus citellus)
L. BORECKY with the technical assistance of L. MASSOVA
Institute of Virology, Czechoslovak Academy of Science, Bratislava
The discovery of the phenomenon of virus haemagglutination by Hirst in 1941
made it possible to elaborate various methods for the titration of different viruses
or their antibodies. The importance of this discovery is emphasised by the fact that
it has been used for a more detailed analysis of the properties of viruses (Burnet,
McCrea, Stone 1946, Horvath et al. 1950, Kozinski et al. 1953 etc.).
It appeared that this phenomenon is wide-spread among viruses (and also micro-
organisms) and not only characteristic for viruses of the group mumps-Newcastle
disease-influenza (MNI). The property of haemagglutination has, under suitable
conditions, been demonstrated in an increasing number of viruses (Rivers 1952,
Gajdamovitch-Shubladze 1954, Sweet 1954 etc.). Even today, after 15 years, a de-
finite explanation for this phenomenon has not been given. Many considerations
however, point to an enzymatic process during which, at least in the case of viruses
of the MNI group, the receptor substance, situated either at the surface or in the wall
of the cell, is disintegrated (Hirst 1942, Burnet, McCrea, Stone 1946, Hanig 1948,
Ada, Stone 1950, Gottschalk 1953, Kradolfer 1954).
The phenomenon of haemagglutination is also a frequent subject of research
because it is a model for the interaction between virus and cell. Even though it might
be objected that the virus (according to present knowledge) does not multiply
within the erythrocyte, yet there are many arguments in favour of such studies.
There is no doubt that:
1. Mechanisms preventing agglutination prevent infection (enzyme destroying
receptors-RDE-Stone 1948, Fazekas de St. Groth 1948, Gottschalk 1953, poly-
saccharides-Horsfall, Ginsberg 1949, chlorophyllin-Barnard 1954).
2. Some virus are capable of agglutinating not only erythrocytes but also other
animal cells (spermatozoa, fibroblasts, Chu 1953). The above also justifies the present
study in which the existence of a specific receptor substance on the surface of
erythrocytes of the ground squirrel (Citellus citellus) is demonstrated. This sub-
stance reacts selectively with some representatives of the group MNI.
Erythrocytes of the ground squirrel (Citellus citellus) were obtained by heart puncture. Their diameter
is 5 - 6y, they have no nuclei and are circular. They differ from red cells of other laboratory animals
by being Rh positive and having antigens of group AB. Hen erythrocytes were also obtained by heart
puncture. Both kinds of red cells were tested, usually in parallel experiments.
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Virus: The following were used:
1. Influenza virus type A: Strain PR8, Weiss;
type A': FM 1, Rhodes, Sweden, HJ52, C's. 4/54, Lis. 5/54, Os. 6/54;
type B: Lee, N. 49, Os. 1/1952, Os. 3/1952, Os. 4/1952;
type C: C - 1233 (Taylor), RM 13/53 - Hung, Lis. 1/1952, Os. 3/52.
2. Swine influenza virus: infl. suis Bratislava - 55 (Sw-55).
3. Mumps virus: Strain-Hanle (Mu).
4. Virus of Newcastle Disease: Strain Bratislava (NDV).
5. Vaccinia Virus-Strain "Biogena" (Vakc.).
The receptor destroying enzyme (RDE): was prepared from the strain V. cholerae 4Z by passage
through the allantois of 12-day-old chick embryos. The titre usually 1 : 512-1024.
The haeimagglutination titres were determined by the test-tube method (Blabkovib at al. 1953).
Disintegration of the erythrocyte receptors by the action of the virus was determined according to White
(1953).
Disintegration of receptors by the action of RDE. The method of White slightly modified (1953) was used-
The degree of disintegration of virus receptors was determined in haemagglutination tests with
6 standard viruses of the group MNI.
The course of absorption and elution of virus on erythrocytes was determined according to Koziilski,
Mikulaszek and Sitek (1953).
1. It was ascertained that the ground squirrel erythrocytes are agglutinated
by viruses of Influenza type B and C and atypically by the virus of Newcastle
Disease (NDV) (the prozone was constantly present). Agglutination of ground
squirrel erythrocytes was never observed with the virus of influenza type A, A', the
virus of swine influenza, of mumps and of vaccinia. For the B strains of influenza
virus, haemagglutination titres (with
0.5% erythrocytes) were about equal Table 1.
for ground squirrel and hen red cells.
These titres were 4-8 times lower
Agglutina-
for ground squirrel than for hen t
ion of ground
when type C was used. Agglutina- squirrel Probable type of virus
tion of ground squirrel red cells was erythrocytes
about the same at 00 C, + 40 C
and room temperature but was not
1. Influenza virus type B
observed at 37? C.
+ 2. Influenza virus type C
Elective agglutinability in the case
3. (Virus of Newcastle disease)
of 5 B strains was confirmed using
virus fluids of 10 different egg pass-
1. Virus of influenza type A
ages (strain Lee was from the 154th
2. Influenza virus type A'
passage, the other strains from the
- 3. Swine influenza virus
11th to 48th passage.) 4 C strains were
4. Mumps virus
tested on material from 5 passages 5.
. Virus of Vaccinia
to 17th). Repeated tests for ag-
glutinability of ground squirrel red Note: () - haemagglutination with the prozone.
cells with other representatives of the Schematic Division of Tested Viruses According to
group MNI under different conditions Their Ability to Agglutinate Ground Squirrel Erythro.
of temperature, duration, incubation cytes.
were repeatedly negative.
The above indicates the possibility of the practical use of ground squirrel erythro-
cytes for determining the type of an unknown virus (tab. 1).
. 2. The characteristics of the virus receptors on ground squirrel erythrocytes were
studied with special reference to two virus strains with which the red cells ag-
glutinate: virus Lee (type B) and virus C/Cs. 1952.
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It was found that virus Lee is nearly quantitatively adsorbed on ground squirrel
red cells within half an hour while for virus C the degree of adsorption is proportional
to the amount of red cells added to the virus fluid (fig. 1).
Fig. 1B represents the adsorption of virus C on ground squirrel red cells after having
been exposed to undiluted RDE. The degree of adsorption is found to be greater
on to red cells thus prepared
than on to the same amount of
512 A cytes. A similar effect of RDE
256 on hen red cells could not be
128 demonstrated.
64 Fig. 2 shows the course of
52 adsorption and elution of virus
16 Lee and C on to ground squir-
e rel and hen erythrocytes (0.4
4 ml. of a 50% erythrocyte
< suspension per 1 ml. virus fluid).
K 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,0 ml
512
256
128
64
32
16
8
I
K 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 ml
20 20 20 20 20
Fig. 1. A. Degree of adsorption of virus
Lee and C on to different amounts of
ground squirrel erythrocytes at 0? C.
White column - virus C. Black column
- strain Lee. B. Adsorption of virus C
on to ground squirrel erythrocytes after
previous action of RDE on the ery
throcytes. K - control. White column
- virus C. Black column - virus C
after RDE. x: erythrocytes in ml. 20
and 40 % cone. y : titre of agglutination.
The curves are the same for both hen and ground squirrel erythrocytes. It can also
be seen that preliminary adsorption and elution of virus Lee on to erythrocytes
has no effect on adsorption and elution of virus C on to ground squirrel and hen
erythrocytes. A similar phenomenon was observed on hen red cells by Hirst (1950).
3. When studying the ability of different viruses of the group MNI to destroy
virus receptors on ground squirrel and hen erythrocytes, increased agglutinability
f024
512
256
128
64
32
f6
Fig. 2. The course of adsorption and elution of virus Lee and C on to ground squirrel (A) and hen (bird-B)
erythrocytes. Curve 1 - C after Lee, 2 - C, 3 - Lee. x: time in min. at 0 and 37 ?C. y: titre of agglutination.
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of ground squirrel erythrocytes by virus C was observed after preliminary treatment
of those erythrocytes with virus Lee. This was specific for ground squirrel erythro-
cytes. A typical experiment is shown in tab. 2 (hen erythrocytes) and tab. 3 (ground
squirrel erythrocytes).
Ku20,81~ t
KJ 512
K5- 256
128
64 1\
/ ,
K6- 32
4096
KJ-2048
1024
512
Kf- 256
K2 128
64
32
16
8
cf
Fig. 3. The effect of RDE on receptors of hen (A) and ground squirrel (B) erythrocytes. Curve 1 - C 52,
2 - Lee, 3 - NDV, 4 - A'54, 5 - PR 8, 6 - Mw. K - control titre. x: RDE units. y: titre of agglutination.
The experiments also demonstrate that the action of different viruses on ground
squirrel erythrocytes does not affect the elective agglutinability of these erythro-
cytes (the red cells did not acquire the ability to agglutinate with virus of influenza
A, A', mumps and swine influenza).
4. Samples of RDE had an effect similar to virus Lee, i. e. the haemagglutinating
titre of ground squirrel erythrocytes with virus C increased considerably after
previous incubation with RDE (1000-2500 IU).
Fig. 3 shows the receptor gradient based on the effect of RDE. Results with hen
erythrocytes are in agreement with the literature (Burnet, McCrea, Stone 1946,
Kozifiski, Slonim 1952a, b, fig. 3a) and demonstrate that the method used was
correct.
Discussion
It was demonstrated that ground squirrel erythrocytes agglutinate electively with
the viruses B, C and NDV. This can be utilised for diagnostic purposes for newly
isolated or unknown virus strains. Comparisons of agglutinating and adsorbing
characteristics of different red. cells have been made several times (Hirst 1942,
Burnet, Stone 1946, Horvath et al. 1950, Farkas 1950, Kozi iski 1953 and others)
but elective agglutinability within the group MNI was pointed out only by Tamm
(1954) using cat erythrocytes. Horvath et al. (1950) mention that hamster
red cells can be agglutinated with virus Lee but not with virus PR 8 and NDV
Table 2. Action of Viruses on Hen Erythrocyte Receptors.
Erythrocytes after
Haemagglutination tests with the viruses
action of virus
PR 8
LEE
A'- 54
C - 52
NDV
Mu
Sw - 55
LEE
256
512*)
256
2048
-
- 512
C - 52
512
512
512
-
1024
- 256
NDV
128
256
256
2048
-
- 256
Sw - 55
512
512
512
2048
1024
- 512
Control
512
512
512
2048
2048
64 1 512
') Titre of Lee dropped to 25 % in some cases after the action of virus LEE, in other cases it did not
change.
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Table 3. Action of Viruses on Ground Squirrel Erythrocyte Receptors
Erythrocytes after
Haemagglutination tests with the viruses
action of virus
PR 8
LEE
A'- 54
C - 52
NDV
Mu
Sw - 55
LEE
-
128
-
4096
-
-
-
C-552
-
256
-
-
512
NDV
-
256
-
256
-
-
-
Sw - 55
-
256
-
256
256
-
-
Control
-
512
-
128
512
-
-
but pay no further attention to this fact. We believe that a study and comparison
of erythrocytes with specific receptors, extended by biochemical analysis, may
throw further light on the problem of virus substrates and the question of the patho-
genesis of virus diseases.
The effect of virus Lee and more concentrated samples of RDE on ground squirrel
erythrocytes caused increased haemagglutinating titres when using virus C; an effect
not observed before.
It is not possible to give an exact explanation for this phenomenon but our
experiments are further confirmation of the conception of Kozinski and Slonim
(1952a, b, 1953) of the laminar arrangement of virus receptors on the surface of
the red cell. These authors base their conception on the successive destruction of the
more superficially situated receptors by viruses that are in a more advanced position
of the receptor gradient. The present study on ground squirrel red cells indicates
that it is correct to accept this conception as undiluted preparations of RDE and the
action of virus Lee (situated at the end of the gradient for hen erythrocytes) make
it possible to "uncover" receptors for virus C that, otherwise, is covered by certain
insufficiently known structures of the cell surface.
This "uncovering" of the receptors is also indicated by the fact that the degree
of adsorption of virus C on to ground squirrel erythrocytes is increased by the action
of RDE. This was not observed in the case of hen red cells. It was, however, not
possible to find an increased adsorption of virus C on to ground squirrel erythrocytes
after the action of virus Lee. This question remains open for the time being as also
others (Hirst 1950, Horvath et al. 1950) have pointed out that there is no
agreement between agglutinability and adsorption power. It may be assumed that
although there is a considerable similarity between the effects of virus and
RDE, there are certain fine differences that may have played a part in our experi-
ments. This difference has been pointed out by Stone (1947) from the point of view
of the successive order of individual representatives of the receptor gradient. Attempts
to influence agglutinability of ground squirrel erythrocytes using trypsin and
diastase were unsuccessful and therefore are not considered here.
Remark. After receiving the virus type D (strain Sendai) we found that this virus
was also able to agglutinate ground squirrel erythrocytes.
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apHTpouHTOB cycsrHua Citellus citellus
MbI yCTaHOBIIJIIt, =ITO 3PHTpOUHTbI Cyc1IHHa (Citellus citellus) arrduoTNHI1pyIOTCH
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FOLIA BIOLOGICA
The Action of Streptomycin on the Flagellate Euglena gracilis Klebs
J.VAVRA
Protozoology Laboratory, Czechoslovak Academy of Science, Praha
In studying apochlorosis caused by streptomycin in E. gracilis, it was first of all
necessary to investigate the toxicity of streptomycin for this protozoon. Toxicity
is closely related to inhibition of growth of a culture, both factors actually coinciding
with each other. In the further work we shall therefore distinguish: a) immediate
toxicity (24 hours), as toxicity and b) protracted toxicity (over 24 hours) as inhibition.
The first part of this communication deals with toxicity, the second with inhibition.
1. The Toxicity of Streptomycin
As stated by Jfrovec (1949), the toxicity of streptomycin for Euglena gracilis
is very small; even 25% streptomycin does not display any toxic action in a 24-hour
experiment.
For our experiments, various strains of E. gracilis were used, which had been
cultured in the Protozoology Laboratory of the Czechoslovak Academy of Science
(Provasoli strain = E. gracilis, var. urophora). The culture medium was composed
of 2 g. Na acetate, 5 g. peptone, 0.5 g. Difco yeast extract, 1,000 ml. redistilled
water, pH 6.8. The cultures were kept in a lighted thermostat at a temperature
of 25? C. The following series of dilutions were tested: 100,000 units/ml., 50,000
units/ml., 25,000 units/ml., 10,000 units/ml., 5,000 units/ml. Toxicity was studied
in a normal 24-hour experiment as described by Jfrovec (1947). Streptomycin
partially inactivated by boiling was used as control. It was found that E. gracilis
reacted to these high concentrations of streptomycin chiefly by complete, or at least
partial, loss of motility. In a number of Euglenas this loss is reversible and after
a time some of them regained their motility and swam normally, even in the highest
concentrations. It was further found that different strains react differently to large
doses of streptomycin. The six strains tested can be divided roughly into two groups.
The group of the Mainx, Dusi II and Provasoli strains lose little of their motility
and soon regain it. The Dusi I, Pringsheim and Lwoff strains lose their motility
to a far greater degree and have difficulty in regaining it. These two groups also
differ in other of their physiological properties (the first group grow at 28? C and are
bleached by streptomycin, the second group do not grow at 28? C and are not
ordinarily bleached by streptomycin). It was further found that after large doses
of streptomycin, the majority of Euglenas remained alive and retained their ability
to proliferate. Osmotic pressure does not probably participate in the changes
described, since with a concentration of 100,000 units/ml. it does not quite reach
5 atmospheres, whereas E. gracilis just tolerates 0.2 M saccharose, the osmotic
pressure of which is precisely 5 atmospheres. The morphological picture of the action
of streptomycin and of high osmotic pressure also differ.
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II. Inhibition of Growth of Cultures by Streptomycin
As ascertained by Jirovec (1949), the action of streptomycin on protozoa is mainly
of an inhibitory character. In E. gracilis, inhibition is approximately the same
in the light as in the dark. Provasoli et al. (1948) came to different conclusions.
In experiments with E. gracilis var. bacillaris they observed that streptomycin.
retarded growth in the light, not in the dark. In their experiments, some types
of Astasia were likewise not inhibited even with doses of 5,000 ?g./ml. streptomycin.
Material and Method
The observations were carried out in the same strains as used in the experiments for toxicity, which
were also cultured under the same conditions. The amount of streptomycin tested was the same in all
the experiments, viz. 1,000,ag/ml. dihydrostreptomycin sulphate. Care was taken that the amount of
each individual strain inoculated was always the same; inoculation was therefore carried out quantitatively
by the method described by VAvra (1956, in press). The organisms were counted in a Barker chamber.
The number resulting from division of the average number of organisms in an untreated culture by the
average number of organisms in a culture treated with streptomycin was taken as the inhibition index,
i. e. control under specific conditions/ experiment under the same conditions = index of inhibition.
Index 1.0, therefore, means that inhibition has not occurred. The same applies to indices less than 1.0
(which means that there are actually more cells in the culture treated with streptomycin than in the
control). Indices up to 1.1 indicate weak inhibition, which may still be within the limits of experimental
error. If the index rises, inhibition also rises, and vice versa.
The Mainx, Dusi II and Provasoli strains (var. urophora), cultured in the light:
in all these strains, discernible inhibition occurs in the light. The inhibition index
is small at first, but in time increases (tab. 1).
It is interesting to compare the inhibition index with the dose of streptomycin
which causes bleaching of the various strains. The lower the inhibition index, the less
the possibility of bleaching (i. e. larger doses of streptomycin are required) and thus
the chloroplast remnants are retained longer.
Inhibition Index
Strain
5 days
7 days
Mainx
1.2
1.8
Dusi II
1.0
1.4
Provasoli
1.7
5.0
Inhibition Index
Strain
6 days
8 days
Mainx
0.8
1.0
Dusi II
0.9
1.0
Provasoli
1.0
0.8
The Mainx, Dusi II and Provasoli strains cultured in the dark: in all these strains
inhibition does not occur in the dark. The average number of organisms in cultures
without and with streptomycin is approximately the same-there are actually even
more cells in cultures treated with streptomycin (tab. 2).
From the facts given above it may concluded that in the Mainx, Dusi II and
Provasoli strains true inhibition does not occur (in the sense of protracted toxicity),
either in the light or dark. The result in the dark is absolutely clear, but in light
there still remains the fact that the density of the Euglena population is far greater
in cultures not treated with streptomycin. This, however, may be explained by the
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phenomenon that owing to the action of the streptomycin these strains lose their
chloroplasts, as a result of which they also lose the advantages of photosynthesis.
Their proliferation is therefore slower as compared with the green control Euglenas.
The increase in the inhibition index may be explained partly by exhaustion of nutrient
material from the culture, as a result of which the conditions for Euglenas which
have lost their capacity for photosynthesis are worsened still further. The cyto-
logical picture of the loss of chloroplasts in these strains may also explain an increase
in inhibition. As will be demonstrated in further communications, the chloroplasts
are lost by not completing their growth on division and thus becoming progressively
fewer. In Euglenas affected by streptomycin, therefore, the capacity for photo-
synthesis decreases and their division is thereby retarded.
Streptomycin acts on these strains, therefore, in a similar manner to transfer
into the dark.
The Dusi I, Pringsheim and Lwoff strains, cultured in the light: In these conditions,
the inhibition index reaches higher values at the outset of the experiment than in the
further course of growth of the culture, i. e. in an opposite manner from the other
strains (tab. 3).
In checking the growth of these strains, longer periods had to be selected, because
of their slow growth.
Dusi I, Pringsheim and Lwoff strains cultured in the dark: Under these conditions
strong inhibition was found (tab. 4).
Inhibition Index
Strain
12 days I
19 days
Dusi I
3.1
1.5
Pringsheim
1.6
1.1
Lwoff
1.2
1.0
Inhibition Index
Strain
14 days
21 days
Dusi I
growth insuff.
3.0
Pringsheim
growth insuff.
6.4
Lwoff
1.8
2.3
These strains do not become apoplastidic through the action of streptomycin.
We assume that in these strains streptomycin interferes in some metabolic processes
by means of which the organism utilizes organic substances from the environment
for its nutrition, much as described by Umbreit (1951). This is evidently the reason
why'there is at first only small inhibition in the cultures kept in the light, since these
cannot very well utilize organic substances from the environment; their photo-
synthetic capacity is not, however, damaged and they therefore grow quite well.
In the green cells of the controls, proliferation is at first more rapid; in this case
the Euglenas are both photosynthetic and also utilize organic substances. In time,
however, the organic substances are exhausted and further proliferation is therefore
retarded. Euglenas treated with streptomycin, however, continue to be photo-
synthetic and in time the number of cells in the control culture and in the culture
treated with streptomycin equalize. In a decrease in the inhibition index, however,
disintegration of the streptomycin or adaptation of the organism may play a part.
The inhibitory effect is far more evident in cultures in the dark, since it is not con-
cealed by photosynthesis.
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It is evident that the apparently contrasting results of Jirovec and Provasoli
do not basically conflict with each other and that the results obtained by these two
authors do not exclude each other. The lack of agreement may be explained by the
physiological variability of the various strains of E. gracilis.
Summary
True inhibition of growth of cultures of E. gracilis by the toxic action of strepto-
mycin was found only in the strains Dusi I, Pringsheim and Lwoff. This inhibition
was clearly evident only in culturing these strains in the dark, when it was not con-
cealed by photosynthesis. Inhibition in the strains Mainx, Dusi II and Provasoli
in light is only apparent and is due to the fact that the Euglenas of these strains
become apochloroplastidic owing to the streptomycin and thus lose the advantages
of photosynthesis and therefore proliferate more slowly than the green control
Euglenas. This inhibition is therefore secondary and non-specific (darkness produces
a similar effect). When the Mainx, Dusi II and Provasoli strains are cultured in the
dark, the action of streptomycin dose not cause inhibition.
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ek1CTBKe CTpeHTOMH1A1,1Ha Ha ?I{PyTHKOBbIX Euglena gracllls Klebs
10. BABPA
Pe310.4te
TOKC1PJHOCTb CTpeIITOMH9141M
3a TOKC11gHOCTb CTpeIITOMHIuIHa IIpuHHMaJIaCI TOJIbKO TOKCH'IHOCTb, IIpOHBJIHB-
niaHCH IIpl KpaTKOCpOLIHOM OIIbITe B TexieHHe 24 'iac. 14C11bITbIBaJIHCb pa3BeReH11H:
100.000 eA/MJI, 50.000 eA/MJI, 25.000 ea/ma, 10.000 eA/MJI H 5.000 e)/MJI. 14CII0JIb3o-
BaJIHCb pa3JIwIHble IIITaMMbi Euglena gracilis (IIITaMM Provasoli 3T0 E. gracilis var.
urophora). FbIJIO ycTaxoBJIeHO, LITO Ha Taizue BLICOKHe KonueuTpauint CTpeIITOM14-
gIIHa Euglena pearapyeT, rJIaBHbIM o6pa3oM, IIOJIHOIt - HJIn no Kpaf4Heii Mepe
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?IaCTH?iHOf - yTpaTOH IIOjjBHHSHOCTH. Ho y gaCTH oco6eH TO HBneHHe o6paTHMOe,
n nepe3 HCHOTOpoe BpeMH 3TH KneTKH Euglena j[a}Ke upH MaKCHMaJIbHOH H3 HCCne-
jjyeMbix KOHIjeHTpaIjHH CTaHOBHTCg IIOjjBHHCHMIMH H IInaBaIOT HOpManbHO. Ranee
6LIn0 ycTanosneno, 'ITO pa3nHLIHbie IIITaMMbi E. gracilis pa3nH'qHO pearHpyioT Ha
jjeuCTBHe 6OnbmHX A03 CTpeIITOMHIuina. B o6IIjeM Bee 6 HCCnejjOBaBmHXCn mTSMMOB
MO)KHO pa3AeJIHTb Ha 2 rpyrlnu: rpyIIIIa IIITaMMOB Mainx, Dusi If, Provasoli TepgeT
IIOjjBHMHOCTb B O'eHb He3Ha'HTenbHOH CTeIIeHH H BcKope CHOBa ee IIpHo6peTaeT,
Torj[a Kax HITaMMhI Dusi I, Pringsheim, Lwott TOPRIOT ee B ropaaj[o 6onee 3Ha'iH-
TenbHOH CTeIIeHH H BHOBb IIpHo6peTaIOT C TpyjjOM. 06e rpynnbl OTnl'IaIOTCH jjpyr
OT jjpyra H B jjpyrnx OTHOmeHHHX (IIepBan rpynna paCTeT IIpH 28 oC H xopomo
o6eCIjBe'HBaeTCH CTpeIITOMHIrHHOM, BTOpa} rpynna 3THX IIpH3HaKOB He HMeeT). Sbino
YCTaHOBneHO TaKH{e, 'ITO 6onbman ilaCTb Euglena BbI)KHBaeT H IIOR AeIICTBHeM
6Onb1HHX KOHIUeHTpaIjWII CTpeIITOMHIjHHa H COXpaHHeT CIIOCo6HOCTb K pa3MHOH IIIUO.
IIOBHjjHMOMy, OCMOTwieCKoe j[aBneHHe He B IHHeT Ha OIIHCMBaeMbie H3MeHeHHH, TaK
xaK IIpH 100.000 ejI/MJI CTpeIITOMHIjHHa OHO He j(OCTHraeT 5 aTMOc ep, Torjja KaK
E. gracilis IIepeHOCHT 0,2 m caxapo3y, rjje OCMOTH'eCKOe jjaBneHHe COCTaBnaeT
5 aTM. Mop(onornilecKHe KapTHHhI jjeiiCTBHH CTpeTTOMHIjHHa II BbICOKOTO OCMOTH-
mecnoro jjaBneHHH TaI)Ke HeOAHHaHOBbi.
Ho aBneHHe poCTa H JIbTypbl IIOjj j{ efCTBIIeM CTpeIITOMHILHHa
3a Mepy nojjaBneHHg 6bina IIPHHHTa j[IHTenbHaH (6Onbme 24 ilac.) TOKCHgROCTJ
CTpeIITOMHIjHHa, OTpa)KaiowjaHCH Ha CKOPOCTH poCTa KynbTypbl. OIInITbI IIPOH3BO-
J;HJIHCb C IIOCTOHHHNNM KonHileCTBOM CTpeIITOMHijnHa - 1000 ep/Mn AHrHjjpOCTpeIITO-
M11w(HCynb(aTa. 3a uitC9exc noaaeAemuI 6bina-IIplHHTa jjpo6b, BO3HHKaIOlljaa OT ) e-
neHHg cpejjHero HOJIH'OCTBa KneTOK KOHTPOnbHOH KynbTypbi Ha cpeAHee KOnHLIeCTBO
KneTOK HynbTyphI, IIOj[BepraBmeHCH jjeHCTBHIO CTpeIITOMHIjHHa. LIeM Bblme 3TOT
HHj[eHC IIojjaBneHH}, TOM 6onbIIIe TOPMO3HTCH pOCT KynbTypbl HccnejjyeMbiM Bellje-
CTBOM. Y IIITaMMOB Mainx, Dusi II, Provasoli (E. graccilis var. urophora), Bblpa-
IILHBaeMhIX Ha CBeTy, Ha6nloTaeTCH 3aMeTHoe H C Te'eHHOM BpeMOHH IIOBbimalolljeeCH
IIOjjaBneHHe. Y OTj[enbHIIx IIITaMMOB 9TOH rpyIIIIbi HHjjOHCbl IIOj;aBneHHf poCTa
pa3nHLIHM. tleM McHBIIIO nHjjeHc, TOM McHbmc H o6ecIjse*iHBaHHe H TOM jjOnbIIIO
yjjeP)KHBalOTCH OCTaTKH xnopOIInaCTOB. IIPH BblpanjHBaHHH 3THX IIITaMMOB B TeMHOTe
yrHeTeHHe He Ha6nlOAaeTCg. Mm nonaraeM IIOOTOMy, 'ITO TOKCH'eCKOO jjeiCTBHe
CTpenTOMHAHHa He yrneTaeT poCTa HynbTyp 3THx mTaMMOB, HO TaK KaK IIOjj BJIHHHHeM
CTpeIITOMHILHHa 3TH mTaMMbI TepiI1OT XTOpOIIJIaCTbI, TO KneTHH, IIopa neHHme CTpeIITO-
MHIjHHOM, numaiOTCH npeHMylljeCTB (OTOCHHTe3a H IIpHHy?ic aIOTCH pa3Mno KaTbCH
MejjneHHee. 14TaK, CTpeIITOMV HH jjeHCTByeT Ha 3TH IIITaMMbl TaKHM me o6pa3oM,
Haw K no eiijeHne B TeMHOTy.
IIpH BblpaMHBaHHH Ha CBeTy HlTaMMOB Dusi I, Pringsheim, Lwoff uHjjexc IIojjaB-
neHHH poCTa BHailane j[oCTnraeT 3HagHTenbHbix BenHLIHH H nocTeneHHo CHHHiaeTCR.
IIpH HynbTHBaIjHH B TOMHOTe y 3THX mTaMMOB Ha6nlojjaeTCH CHnbHOe yrHeTeHHe
poCTa. IIo) jjeHCTBHeM CTPOIITOMIII[1Ha 3TH mTaMMbI He yTpaiiHBaIOT IInaCTHjjbi.
IIOaTOMy MM IIOnaraeM, 'ITO CTpeIITOMHILHH BJIHHeT Ha HaHue-TO IIpoIjecCbI o6MeHa,
C IIOMOHjbIO KOTOPhIX opraHn3M nCIIOn163yeT jjni IIIITaHH} opraHiaweRHe BC1J CTBa
cpejjM. B TeMHOTe IIojjaBnenHe poCTa KynbTypbl OKa3mBaeTCH ropa3jj0 CHnbHee,
TOK KaK 3jjecb oHo He 3aByan11POBano I OTOCHHTe3OM. 14TaK, OYeBHjjHO, 'ITO Mexcjjy
MHHMO npOTHBOpC I1BMMH pe3ynbTaTaMH pa60T fHpOB1 a (1949) H Provasoli (1948)
HeT IIpHHIj1IIHanbHMX npOTHBOpenHH II iITO jjaHHMe 06oIIx aBTOPOB He HCKniogaIOT
jjpyr apyra. Pa3nH'IHH MOryT O6,b$CHHTbCH 3HagIlTenbHOil 41H3HOAOruTiecKOH
113MOH'IHBOCTbIO HlTBMMOB E. gracilis.
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FOLIA BIOLOGICA
Bemerkungen zur Interferenz der Tabak-Mosaikvirusstamme
C. BLATTNI
Biologisches Institut der Tschsl. Akademie der Wissenschaften, Praha
Der Befund von Mc Kinney (1929) and Thung (1931), dass die in alien Teilen mit
einem milden Tabak-Mosaikvirusstamm (VTM) infizierten Tabakpflanzen an einem
strengen Stamm desselben Virus nicht mehr erkranken, ist zum Gemeingut der
Pflanzenvirologie geworden and dient der Feststellung des Verwandschaftsverhalt-
nisses von Viren. Diese Erscheinung war bereits Gegenstand umfassender Berichte
(Benett 1951, Ryikov 1935, Bawden 1950) and gab Anlass zu wichtigen Folgerungen.
So hat Matthews (1949) nachgewiesen, dass diese Gesetzmassigkeit in bestimmten
Grenzen ihre Gultigkeit besitzt: bei zehn Stammen derselben Virusart stellte er fest,
dass diese Stamme die Pflanze bei Kreuzinokulation desto mehr schiitzten, je naher
sie serologisch verwandt waren. Die auf den angefiihrten Befunden gegrundeten
Schliisse waren unserer Meinung nach allzu sehr von tiervirologischen Gesichts-
punkten beeinflusst. Den Anschauungen des Akademikers Nemec (mundliche
Mitteilung 1955) beipflichtend, dass Tiere and Pflanzen nur die grundlegendsten
Funktionen gemeinsam haben, erachteten wir such einen nur teilweisen Vergleich
immunologischer Vorgange bei Pflanzen and Tieren als nicht befriedigend. In den
Jahren 1953-1955 hatten wir Gelegenheit, mit mehreren VTM-Stammen zu experi-
mentieren, wobei teilweise- Resultate erzielt wurden, die sich von den bisherigen
unterscheiden. Unsere Arbeitsergebnisse aus den Jahren 1953 and 1954 haben wir
bereits zusammengefasst (Blattny 1955) and verweisen auf die in dieser Arbeit
angefuhrten Einzelheiten. Im Jahre 1955 konnten wir diese Befunde an Hand wei-
terer Versuche, fiber die hier berichtet wird, bestatigen.
Material. 1. Der Stamm eines gewbhnliehen Tabak-Mosaikvirus (weiter VTM Typ), der aus Zigaretten
der Marke ,Partyzbnky" isoliert wurde and daher wahrscheinlich slowakischen Ursprungs war, be-
einflusste das Wachatum der Tabakpflanzen wenig and verursachte such bei den ji ngsten Pflanzen
niemals ein Absterben. An den Blattern rief er neben ungleichmassig grunen oder griinen ,Blasen"
grossere oder kleinere Deformationen hervor.
2. Der aus Physali8 franchettii isolierte Alke-Stamm VTM (weiter VTM AL) verursachte bei dieser
Pflanze and bei Physali8 alkekengi weisse Fleeke, gran Blasen and Deformationen. Bei N. tabacum
Samsun erscheinen dieselben Symptome, jedoch sind hier die Deformationen weniger umfangreich,
and die Infektion verlauft bei jungen Pflanzen todlich. Bei N. sylvestris kommt es zu einem Absterben
des Vegetationspunktes and bei systemischer Erkrankung zu einer sekundaren Nekrose der Blatter, bei
alteren Pflanzen zur Bildung weisser Flecken (Blattny 1955).
3. Der VTM-Stamm C (weiter VTM C), der uns freundlicherweise von Prof. Klinkowski zur Ver-
fiigung gestellt wurde, stammt von Kassanis (Rothamsted). In den Symptomen ahnelt er dem vor-
genannten Stamm and bewirkt wie dieser bei Physalis alkekengi and P. franchettii Dekolorationserschei-
nungen. Die beim Goldenen Virginientabak auftretenden Symptome sind unterschiedlich. Die Wirkung
dieses Stammes auf N. tabacum ist wesentlich milder als die von VTM AL.
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4. Der ,Streifen"-Stamm (weiter VTM S) wurde von Svobodov (1954, mundliche Mitteilung 1955)
aus VTM AL durch Kultivierung auf den in Erlenmeyerschen Kolben auf Agar gezogenen Tabakpflanzen
and t)-bertragung auf Pflanzen in normalem Milieu gewonnen. Be handelt rich um einen milden and auf
das Wachatum der Tabakpflanzen noch schwacher wirkenden Stamm ala der in unseren Versuchen ver-
wendete Stamm VTM Typ. Bei N. tabacum ruft or typisohe ,Streifen"-Dekolorationen hervor.
Methoden. A. Inokulation mit einem Stamm and
nach Eintritt der Initialsymptome einer systemischen
Infektion Inokulation des zweiten Stammes.
B. Inokulation mit einem Stamm and vor dem
Auftreten der Initialsymptome einer systemischen
Infektion Inokulation mit dem zweiten Stamm.
0. Inokulation mit einem Stamm and nach
Manifestation der aystemischen Erkrankung der
ganzen Pflanze Inokulation mit dem zweiten Stamm.
D. Inokulation sines Gemisohes zweier Stamme
in verschiedenen Konzentrationen.
VTH-Typ.,(~-. . -~ VTH-C
1*1
E. Zur Detektion der ?farbigen", d. h. der durch
DekoloratiQn in Erscheinung tretenden Stamme
VTM AL and VTM S wurden junge Samlinge von
Physalis alkekengi verwendet, bei denen rich jeder
dieser StAmme auf unterschiedliche Weise mani-
festierte. VTM AL wirkt auf die Pflanzen am ver-
heerendaten, sie gehen teilweise ein, teilweise ver-
kummem sie and such die jungsten Blatter werden
weirs. Ahnlich, aber sohwacher wirkt VTM C, wobei
die jungsten Blatter gleichfalls dekoloriert werden.
VTM S verursaoht achwach gelbliche Dekoloratio-
nen, doch bleiben, besonders zu Beginn der syste-
misohen Erkrankung, die jungsten BlAtter grain. Fair
VTM Typ ist Physalie alkekengi (und P. /rancheuii)
ein symptomloser Trager.
VTH-S
Diagramm der wechaelseitigen,,Schutz"-Wirkung
von VTM-Stammen. - - - - - - - - Fehlende odor
scheinbare ?Schutz"-Wirkung. Tat-
sachliche ?Schutz"-Wirkung. Pfeile bezeichnen
den gegenseitigen ?Schutz". z = nicht durch-
gefuhrter Versuch. Verwendete Stamme: VTM
Typ, VTM AL, VTM C, VTM S.
In allen Fallen wurde des Inokulum in die mit einem Abrasionamittel (Karborundumpulver
320-Mesh.) ladierte Blattepidermis von N. tabacum Samsun appliziert, and zwar zunachst in der Phase
der 2-8 echten BlAtter am 1. bis. 4. echten Blatt, hierauf auf dem nachatfolgenden Blatt. In jeder Serie
wurden Pflanzen der gleichen Wachstumaphase and zur Inokulation BlAtter der gleichen Waohstuma-
klasse verwendet. Die bei jeder Versuchskategorie gleich grossen Versuchsserien umfassten 5-50
Pflanzen. Zur Detektion dienten Samlinge von PhysaUs alkekengi mit 2 Paaren echter Blatter, die Serien
zahlten 5-20 Pflanzen. Die Versuche dauerten von Ende Mai big Ende Juli an, also in der Zeit mit
einem fur das Auftreten der Symptome des VTM Behr gunstigen Licht- and Warmegenusa (16-28 ?C).
Ergebnis8e
1. 1. Bei Anwendung der Methoden A and B stellten wir feat, dass zwischen
VTM AL and VTM C keine wechselseitige Schutzwirkung besteht.
2. Bei Anwendung der Methode B wurde das Fehlen einer wechselseitigen Schutz-
wirkung zwischen VTM C and VTM Typ festgestellt.
3. Bei Anwendung der Methoden A, B and C stellten wir feat, dass VTMAL and
VTM S wechselseitig schiitzend wirken.
4. Bei Anwendung der Methoden A, B and C beobachteten wir, dass VTM Typ'
weder gegen VTM AL noch gegen VTM S schiitzt. Sofern bei der Methode C VTM AL
oder VTM S symptomatisch nicht in Erscheinung traten, konnte die Anwesenheit
dieser Stamme in der Tabakpflanze durch Inokulation auf Physalis alkekengi nach-
gewiesen werden.
5. Bei Anwendung der Methoden A, B and C konnten wir schliesslich feststellen,
dass VTM L Aund VTM S gegeniiber VTM Typ, der rich mit charakteristischen
Symptomen manifestierte, keine Schutzwirkung ausiibte.
Daraus kann auf eine nahe Verwandschaft zwischen VTM AL and dem aus ihm
hervorgegangenen Stamm VTM S geschlossen werden and ebenso auf eine weniger
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nahe Verwandtschaft von VTM AL and VTM S mit VTM Typ Bowie zwischen
VTM AL and VTM C, obzwar letztere sich symptomatisch sehr ahnlich sind.
Wenn bei einigen Pflanzen die Infektion mit einem nichtfarbigen Stamm (VTM
Typ) vor Erkrankung an einem farbigen Stamm (VTM AL oder VTM C) ,schiitzte",
so konnte durch Detektionsokulation auf Physalis alkekengi festgestellt werden,
dass these Schutzwirkung nur scheinbar war. Wurde namlich der Saft von Pflanzen,
die nur die Symptome einer Infektion mit dem Stamm VTM Typ aufwiesen, mittels
RT-Methode unter Verwendung von Karborundumpulver auf Physalis alkekengi
ubertragen, so loste er ein fur die Stamme VTM AL and VTM C charakteristisches
Krankheitsbild (weisse Fleeke u. dgl.) aus.
Es scheint, dass eine tatsachliche Schutzwirkung vor VTMAL durch Infektion
mit VTM S erzielt werden kann, da solche Pflanzen nach Impfung mit einem
VTM AL-Stamm keinerlei Anzeichen der Anwesenheit dieses Stammes aufwiesen.
Durch Inokulation des Saftes dieser Pflanzen auf Physalis alkekengi wurden nur die
fur den VTM S-Stamm charakteristischen Symptome (griines ji ngstes Blatt, die
untersten Blatter mit gelbgefarbten Adern and nicht begrenzten helleren
Flecken) hervorgerufen and keinesfalls das fur eine Infektion mit dem VTMAL-
Stamm typische Krankheitsbild (weisse, begrenzte Fleckenbildung, Blasen, auf-
gewolbte Flachen zwischen den Adern, manchmal auch Blattdeformationen). '
II. Bei Anwendung der Methoden A, B and C stellten wir bei einigen Pflanzen
nach einem veranderlichen Verlauf der komplexen Erkrankungen in dem Auftreten
der Symptome ein Ubergewicht des einen Stammes uber den anderen fest. Bei
Kombination von VTMAL and VTM Typ, oder VTM C and VTM Typ oder VTM S
and VTM Typ war es regelmassig der VTM Typ-Stamm, der in der Mehrzahl der
Falle symptomatisch vorherrschte.
Der Gesamtverlauf and das Endstadium der Erkrankungen war in solchen Fallen
leichter als nach alleiniger Infektion mit einem schweren Stamm (VTM AL oder
VTM C), sodass man von einer symptomatologischen ?Verdrangung" des einen
Stammes durch den anderen sprechen konnte, wenn nicht eine Detektionsokulation
auf Physalis alkekengi zeigen wurde, dass es sich nur um eine scheinbare Verdrangung
handelt. Die Stamme VTM AL oder VTM C waren auch weiterhin in der Pflanze
anwesend, nur blieben ihre Symptome verdeckt. Bei einem Ubergewicht von
VTM Typ uber VTM S war der Krankheitsverlauf im Endstadium schwerer als nach
alleiniger Erkrankung am VTM S-Stamm.
VTM C and besonders VTM AL sind fur die Tabakpflanze schadlicher als VTM Typ,
aber (besonders VTM AL) etwas weniger ansteckend als VTM Typ (Blattny 1955).
Auch VTM S ist weniger ansteckend als VTM Typ. Auf die im Verhaltnis zu VTM Typ
geringere tlbertragbarkeit von VTM AL (Blattny 1955) schliessen wir aus drei
Gri nden: a) bei gleichem Inokulationsmodus ist die Zahl der positiv verlaufenden
Infektionen bei Verwendung von VTM Typ grosser als bei VTM AL; b) die Zahl
der Lasionen bei N. glutinosa ist bei Inokulation von VTM Typ grosser als bei jener
mit VTM AL; c) die Verdunnungsgrenze des Rohsaftes nach Impfung von N. tabacum
and Lycopersicum esculentum liegt bei VTM AL tiefer als bei VTM Typ. Das Vor-
herrschen eines Stammes konnte seinen Ursprung gerade in seiner hoheren Infektio-
sitat haben, die sich innerhalb des Pflanzenindividuums ebenso geltend machen kann
wie bei einer t7bertragung zwischen einzelnen Individuen.
III. Wurde nach unserer Methode D als Inokulum das Gemisch zweier Stamme
beniitzt, z. B. VTM AL and VTM Typ oder VTM C and VTM Typ oder die Kombina-
tion eines strengen and weniger strengen Stammes (z. B. VTM AL and VTM C),
so kam es zu einer Erkrankung, deren Symptome die Anwesenheit beider Stamme
and in einigen Fallen das Vorherrschen von VTM Typ erkennen liess.
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Auch bei dem Vorherrschen der fur, VTM Typ charakteristischen Symptome
konnte die Anwesenheit von VTM AL oder VTM C durch Detektionsokulation auf
Physalis alkekengi nachgewiesen werden. Per gesamte Krankheitsverlauf and das
Endstadium war bei Infektion mit flem Gemisch eines strengen and milden
Stammes oft leichter als nach alleiniger Infektion mit einem strengen Stamm. Auch
die Zahl der Lasionen bei N. glutinosa, die durch Inokulation des Saftes aus den auf
these Weise komplex erkrankten Pflanzen von N. tabacum Samsun hervorgerufen
wurden, pflegte kleiner zu sein als die Zahl der Lasionen bei Kontrollpflanzen, die
lediglich an VTM AL oder VTM C oder VTM Typ erkrankt waren.
IV. Bei Beobachtung des Krankheitsverlaufes an N. tabacum Samsun stellten wir
fest, dass die scheinbare ,Verdrangung" in betrachtlichem Masse von klimatischen
Bedingungen abhangig war. Der VTM-Typ, mit dem experimentiert wurde, trat
symptomatisch am charakteristischsten bei Temperaturen von 18 bis 25 ?C in
Erscheinung, VTMAL bei minimal 20 ?C, weitaus am besten aber bei Temperaturen
uber 30 T. Diese Umweltsbedingungen sind dann massgebend dafiir, inwieweit bei
derselben Pflanze die Symptome dieses oder jenen Stammes, and zwar auch voruber-
gehend auftreten.
Disku8sion
Die Stamme VTM AL and VTM C sind strengere, d. h. fur die Pflanze gefahrlichere
Stamme als die Stamme VTM Typ oder VTM S, doch besitzt VTM Typ gegenuber
VTM AL and VTM C keine Schutzwirkung. Per Stamm VTM S, der fur die Pflanze
weniger gefahrlich ist als der Stamm VTM Typ, schutzt nicht vor diesem Stamm.
Physalis alkekengi, die bei Detektionsinokulation den Nachweis der latenten An-
wesenheit der beiden erwahnten ?farbigen" Stamme ermoglicht, zeigte, dass der
Schutz symptomatisch nur in jenen Fallen ist, in denen die Symptome des ?farbigen"
Stammes nicht in Erscheinung treten. Ein effektiver ?Schutz" oder sein Fehlen
liesse sich mit dem Verwandschaftsverhaltnis der Stamme erklaren. Eine tat-
sachliche Schutzwirkung konnten wir niir bei VTM S vor VTMAL feststellen.
Best (1954) hatte bei seinen Versuchen mit Kreuzinokulation milder and strenger
Stamme von Lycopersicum virus 3 (TSW-tomato spotted wilt) festgestellt, dass der
milde Stamm E die Pflanze zwar vor dem strengen Stamm B schutzt, dass es aber trotz
diesem ?Schutz" zu einer bedeutenden Verminderung des Ernteertrages kommt,
der allerdings bei diesen ,geschfitzten" Pflanzen hoher ist, als bei den lediglich am
strengen Stamm erkrankten Pflanzen. Dieselbe Feststellung machte der Autor bei
Inokulation eines Gemisches beider Stamme.
Nach der herkommlichen Theorie sollte die an einem milden Stamm erkrankte
and gegen einen strengen Stamm geschutzte Pflanze iiberhaupt eine unverminderte
Ernte einbringen. Bei Best war dies nicht der Fall, and in unseren Versuchen war
die Pflanze bei einem Vorherrschen des milderen Stammes and nach Inokulation
des Gemisches von schwerem and mildem Stamm sogar weniger beschadigt als bei
alleiniger Infektion mit einem strengen Stamm.
Die Tatsache, dass in Pflanzen Gemische von Virusstammen bestehen konntn, ist
unbestreitbar and kann damit erklart werden, dass neue Stamme durch Veranderung
eines Teiles der Viruspartikel entstehen oder dass nach vorangegangener Infektion
mit einem Stamm eine Neuinfektion mit einem weiteren Virusstamm hinzukommt.
Es kann mit Grund angenommen werden, dass der zweite Weg haufiger ist. Nach den
in der Natur gewonnenen Erfahrungen zu schliessen, kann eher eine Koexistenz
mehrerer Stamme als die Existenz eines einzelnen Stam,nes in der Pflanze erwartet
werden. Es ist daher anzunehmen, dass eine bereits viruskranke Pflanze mit grosserer
Wahrscheinlichkeit noch an einem zweiten Stamm erkrankt, als dass eine solche
weitere Erkrankung nicht eintritt.
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Fur die Erklarung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer Koexistenz
von Virusstammen diirfte der Hinweis auf die Verwandschaft der Stamme kaum
ausreichen. Beide Stamme VCM 1, der grune and weisse, sind zweifelsohne mit-
einander verwandt and es sollte daher bei Kreuzinokulation der eine Stamm vor dem
anderen schf tzen. Bei einer Vbertragung mit Hilfe von Cuscuta sp. (Schmelzer-
mundliche Mitteilung 1955) ist dies nicht der Fall, da auf dieselbe Pflanze zunachst der
gelbe and dann auch der grune Stamm ubertragen werden kann. her macht sich
wahrscheinlich eine historisch gegebene Beziehung, eine uralte Angewohnheit beider
Stamme an die Koexistenz geltend. Wir nehmen daher an, dass these Erscheinungen
komplizierter sind, als friiher angenommen wurde, and ein weiteres Studium er-
forderlich machen.
Zusammen f assung
Mc Kinney and Thung haben nachgewiesen, dass bei Tabakpflanzen, die mit
einem milden VTM-Stamm infiziert waren, ein anderer, kraftig wirkender Stamm
desselben Virus keine Erkrankung mehr hervoruft, sofern der milde Virusstamm
bereits in alle Pflanzenteile eingedrungen ist. Mathews erbrachte den Beweis, dass
bei Kreuzinokulation der Schutz der Pflanzen von der serologischen Verwandschaft
der Stamme desselben Virus abhangt. Best wies darauf hin, dass ein milder Stamm
des Lycopersicum virus 3 zwar Pflanzen vor einem schweren Stamm schiitzt,
trotzdem aber eine bedeutende Ertragsverminderung bewirkt, die allerdings geringer
ist als bei den nur mit einem schweren Virusstamm infizierten Pflanzen.
Es wurde mit den Stammen VTM Typ, VTM C, mit dem neuen ?farbigen"
Alke-Stamm des VTM (weiter VTMAL) and mit dem aus letzterem entstandenen
,,Streifen"-Stamm (weiter VTM S) experimentiert. Je naher das Verwandtschafts-
verhaltnis der Stamme war, desto grosser war die Schutzwirkung der Kreuzinokula-
tion fur die Pflanzen. Eine wechselseitige Schutzwirkung bestand nur zwischen den
Stammen VTM Al and VTM S, nicht aber zwischen den Stammen VTM Typ and
VTM AL and ebensowenig zwischen VTM C and VTM AL, obzwar sich die beiden
letzteren Stamme symptomatisch ahnlich sind. Wo es dennoch zu einem ?Schutz"
kam, war dieser nur scheinbar; eine echte Schutzwirkung ergab sich nur zwischen
den Stammen VTM AL and VTM S.
Bei Kombination zweier Stamme (VTM AL plus VTM Typ, VTM C plus VTM Typ,
VTM S plus VTM Typ) kam es bei Kreuzinokulationen zum Vorherrschen der Symp-
tome eines der beiden Stamme, in der Regel des VTM Typ. (Die Kreuzinokula-
tionen wurden vor oder nach Manifestation der Initialsymptome der systemischen
Infektion oder nach systemischer Erkrankung der ganzen Pflanze an dem zuerst
inokulierten Stamm durchgefuhrt.) Das Endstadium der Erkrankung verlief in
diesen Fallen leichter als nach alleiniger Infektion mit dem schweren Stamm.
In alien Fallen, wo ein Stamm scheinbar von einem anderen ,verdrangt" wurde and
wo VTM AL, VTM C oder VTM S bei der vorher mit VTM Typ inokulierten Pflanzen
keine charakteristische Symptome hervorriefen, konnte die Anwesenheit dieser
Stamme in der Pflanze mit Detektionsinokulation auf Physalis alkekengi nach-
gewiesen werden, die spater typische Dekolorationserscheinungen aufzeigte. Die von
den Umweltbedingungen abhangige ,Verdrangung" des einen oder anderen Stammes
war oft nur von voriibergehender Art.
Wurde fur das Inokulum ein Gemisch zweier Stamme verwendet, so trat die An-
wesenheit beider Stamme im Krankheitsverlauf symptomatisch in Erscheinung,
wobei in einigen Fallen die Symptome des VTM Typ vorherrschten. Auch hier konnte
die Anwesenheit des VTM AL and VTM C-Stammes durch Inokulation auf Physalis
alkekengi nachgewiesen werden. Der Erkrankungsverlauf war bei Inokulation mit
dem Gemisch eines schwach and kraftig wirkenden Stammes im Endstadium oft
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leichter als nach alleiniger Infektion mit einem kraftigen Stamm. Die Zahl der
Lasionen bei Nicotiana glutinosa war bei Inokulation gemischter Stamme ge-
wohnlich niedriger als bei Inokulation eines einzigen Stammes.
Die Tatsache, dass in Pflanzen Gemische von Virusstammen bestehen konnen,
ist unbestreitbar and kann damit erklart werden, dass ein Teil der Viruspartikel sich
verandert oder dass nach vorangegangener Infektion mit einem Stamm eine Neu-
infektion mit einem weiteren Virusstamm hinzukommt.
Fur die Erklarung des Vorhandenseins oder der Koexistenz verschiedener Stamme
diirfte der Hinweis auf die Verwandtschaft der Stamme nicht ausreichen. Aus einigen
Erfahrungen kann geschlossen werden, dass sich auch ein historisch gegebenes Ver-
haltnis, eine uralte Angewohnheit der Stamme, bei ihrer Koexistenz geltend machen
kann.
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H Toro we BKpyca ceponoruUecKII B3aHMH0 6nHxce ipyr K Rpyry, TeM 60nbme 0HH
3aERHruaIOT paCTeHHe npu IIepeKpeCTHOH IIpuBHBKe. Mbi H3ynaeM 3TOT Bonpoc Y He-
HOTOpbIX mTaMMOB BTM c 1953 r. HaCTouri ee coo6u eHIIe o6 3THX pa6oTaX HBnaeTCH
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MaTepuanOM HaM cayxcnnII 4 IIITaMMa: 06hIKHOBeHHaf Mo3aHKa Ta6aKa (THHHi1Hb1i[
BTM - TYP); Alke-mTaMM (BTM AL), BbuujeneHHbIH H3 Physalis franchettii;
06pa3yIOll HI3 IIOJIOCKII HITaMM (BTM-C), IIonyeeHHbliii IIyTeM H3MeHeHHH Alke-
mTaMMa CB060JJ;0B0I3, 11 C-mTaMM (BTM-C), nlo6e3HO ripe tocTasneHHbwu HaM HnH-
HoncKHM, OT RaccaHHca H3 POTaMmTe ITa. Tax me, KaK II BTM-AL H BTM-C, OH BbI-
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franchettii. BTM-S BN3hIBaeT y Physalis alkekengi TOnbKO nerxoe HceuTOBaroe
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B. 11pIIBHBI{a OAHIIM IHTaMMOM H e ie go IIOFIBJIeHHH IIepBHgHbIX npn3HaKOB IIPHBIIBKa
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B) IIpH HpHMeHeHHlI McTOJjOB A, B, B BbIHCHIIJIOCb, IIT() BTM-AL 3aluHH.jaeT
OT BTM-S, a BTM-S 3alui in aeT OT BTM-AL.
r) IIpH HCIIOJIb3OBaHHII McTOAOB A, B, B 6bIJI0 yCTaHOBJIeHO, ITo BTM-TYP
He 3awHnjaeT HH OT BTM-AL, HH OT BTM-S. EcJIH C IIOMOIubIO MOTOJja B HPH3Ha}l3
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i) IIpn HCHOJIb3OBaHHH MOTOJjOB A, B, B 6i,mo HaHJjeHo, 'iTO BTM-AL ii BTM-S
lie 3aluHluaIOT OT BTM-TYP.
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Ho H B 3THX c iyqaix HanHLIHe AL-mTaMMa HnM C-mTaMMa MO)KHO 6bin0 Ao a3aTb
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nosa, IIPHBHTOg coxoi xoMIInexcHO aapa)HeHHblx pacTeHHn Nicotiana tabacum
Samsun, 6buBamO Mime McHbme, geM xOnHgeCTBO IIHTOH OT coKa IOHTpOnbHIIX
paCTeHHH, 3apaxceHHbIX TOJIbKO mTaMMaMH BTM.
Best (1954) ycTaHOBHJi, LITO y ((6pOH3OBOCTH> TOMaTOB (yMepeHHNIIf)> fTaMM E,
XOTH H 3anwu(aeT paCTeHHe OT ((TH)xemOPOi) 3a60neBaHHH nTflMMOM B, HO IIpH TaKOH
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paCTeHHei, 6onbHIIX OAHHM TOJIbHO RTH)KenbIM)) mTaMMOM. Taxoe me AeiiCTBHe Ha6m0-
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mTaMMOM.
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MOM paCTeHHe IIOCne HH(e1I[HII BTOPBIM nTaMMOM CKopee Tome OM 3a6oneBaeT (gem
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FOLIA BIOLOGICA
Anatomisch-zytologische Studie caber die Plastiden
der Vegetationspunkte
V. SOSNOVA
Biologisohes Institut der Tschsl. Akademie der Wissenschaften, Abteilung fur Pflanzenphysiologie, Praha
Eingelangt am 25. 8. 1956
Eine notwendige Voraussetzung fur das Studium der Photosynthese ist die
Kenntnis der Morphologie, Physiologie and Genetik der Chloroplasten. Auch wenn
die altere and neuere Literatur reich an Arbeiten ist, die sich mit der Verteilung der
Chloroplasten in den verschiedenen Pflanzenorganen, vor allem in den Blattern
befassen, so gibt es nur wenig Arbeiten, die den Chloroplasten in den Zellen der
Vegetationspunkte im Verlaufe der Pflanzenentwicklung gewidmet sind. Unsere
Arbeit ist bemuht, die Beziehung zwischen den Chloroplasten and dem morpho-
logischen Zustand des Vegetationspunktes von der Keimbildung his zur Entstehung
der Reproduktionsorgane zu untersuchen.
Die Losung der hier gestellten Aufgabe beruht auf der Methodik. Vor allem war es die Unterscheidung
der Chloroplasten von den Leukoplasten, welche die erste Voraussetzung bildete fur die weitere For-
schung, d. i. ft r die Untersuchung der Chloroplasten in den Vegetationspunkten.
1. Mikrochemische Chlorophyllprufungen. Als Versuchsmaterial diente Triticum vulgare Vii., Sorte
,,Chlumecka 12"; Testpflanzen waren Chlorophytum cornosum var. variegatum Hort., Agapanthus
umbellatus L'Herit, Begonia semperflorens nobili8 Ldl. Die Unterscheidung der Plastiden and Chloro-
plasten erfolgte auf mehrere Arten. Unser hauptsachlichstes Bestreben war darauf gerichtet, das Chloro-
phyll in den Plastiden in Gestalt einer unloslichen Verbindung zu fixieren, die den spateren mikro-
technischen Operationen standhalten wiirde. Zur Gewinnung von Phaeophytin beniitzten wir verschie-
dene Sauren (Essig-, 20%ige Trichloressig-, Oxalwein-, Chlorwasserstoff- and Pikrinshure, gesattigt3
Wasserlosung), zur Chlorophyllgewinnung Hydroxyde (Baryum-, Kalzium- and Aluminiumhydrat).
Als Fixierungsmittel wurden auch die Salze von Schwermetallen (Uranylazetat, Uranylnitrat, Blei-
oxydazetat, Kadmiumchlorid-Kisser 1940) beniitzt. Ausprobiert wurden such kombinierte Fixierungen
nach Ripart-Petit, Temper, Holland, ferner Gemische von Pikrinsaure-Sublimat and Formol-Ammoniak
sowie eine physikalische Fixierung (sog. freezing-drying), caber die bereits berichtet wurde (Uhlik 1955).
Samtliche Fixierungen wurden in den verschiedensten Kombinationen gepriift.
Nach den oben erwahnten Fixierungen wurde eino Reihe von t)berfiihrungsmitteln angewendet,
and zwar 96%iger Athylalkohol, Azeton, tertiares Butanol, Dioxan, Isopropylalkohol, n-Butanol, Tetra-
chlor, Toluen, Xylen, Aniin, Benzen, Chloroform and Terpentin. Die verarbeiteten Praparate wurden
in Paraffin, Karbowax R 1000 (Wade 1952) and in verschiedene Seifentypen oder in Stearsaure ein-
gebettet.
Von den Fixierungen bewahrte sich am besten eine kochende Losung von Kaliumbichromat (Neu-
mayer 1922), das mit dem Chlorophyll einen weder in Alkohol noch in Xylen loslichen Niederschlag
abscheidet. Auch in Paraffin ist dieser Niederschlag stabil. Der Nachteil dieser Methode besteht in der
wenig deutlichen grunen Farbe in den Chloroplasten and teilweise auch in einer Deformation der Zellen
durch den Sud.
Alle diese Methoden waren jedoch wenig befriedigend, da keine bei Fixierung, Einbettung u. dgl. voll-
kommen beweiskraftig and ohne mogliche Fehler war. Wir wandten uns daher schliesslich der bisherigen
Standardmethode mit dem Fluoreszenzmikroskop zu, die allgemein zum Chlorophyllnachweis verwendet
wird. Wir rind uns allerdings dessen bewusst, dass such diese Methode das Unterlaufen von Fehlern nicht
ausschliesst (Radley 1939).
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2. Untereuchung des Chlorophylle in den Vegetationspunkten. Als Versuchsmaterial dienten vier
Weizengattungen des tschsl. Sortiments, and zwar ,Poiehnanh" ale Winterfrucht, ,Chluineck6, 12"
ale Halbwintersaat, ?Niva" als Sommergetreide and ? 6eskh piesivka" (Wechselweizen). Des Material
wurde einerseits zu mikroskopischen Dauerpraparaten verarbeitet, andererseits unter dem Fluoreazenz-
mikroskop untersucht.
Bei dem ersten Verarbeitungamodus wurden die Muster fortlaufend jeden zweiten Tag entnommen
and aue jeder Serie fUnf Sprosavegetationspunkte ausprapariert, die durch 24 Stunden mit dem Gemisch
nach Helly fixiert, auf 48 Stunden in gesattigte Kaliumbichromatlosung (37 ?C) eingebracht, 24
Stunden in fliessendem Wasser auagewaschen and mit der tertiaren Butanolreihe in Paraffin uber-
fuhrt wurden. Die Befreiung der Praparate von Paraffin erfolgte mit der Xylol-Alkoholreihe in die eine
Jodlosung in 70 %igem Alkohol and eine 2%ige unterschweflige Natriumthiosulfatloaung eingebracht
wurde. Die Praparate wurden mit dem Regaudschen Hamatoxylin gefarbt. Die Differenzierung wurde
derart gelenkt, dass die KSrner vollkommen schwarz and die KSrnchen in ihnen unsichtbar blieben.
Bei der Sorts ,Chlumeckb, 12" wurde ausserdem nosh eine Modifikation angewandt, indem die Pra-
parate der Vegetationspunkte nach Beizung in 5%igem Alaun mit 1%iger Bordeaux R-Waaser-
losung durch 30 Minuten vorgefarbt [subtraktive Farbungsmethode nach Heidenhain (Wolf 1954)]
and erst dann mit dem Regaudschen Hamotoxylin behandelt wurden. Ale t)berfuhrungsmittel in
Balsam wurde n-Butanol and Xylen benutzt.
Die zweite Verarbeitungsmethode bestand darin, dam die ebenfalls jeden zweiten Tag entnommenen
Sprossvegetationspunkte ausprapariert and unter dem Reichertschen Standard-Fluoreszenzmikroskop
,,Lux UV" untersucht wurden. Die Chlorophyllstrahlung wurde farbig eingezeichnet.
Auf Grundlage der im Jahre 1954 erzielten Ergebnisse arbeiteten wir im folgenden Jahre nur mit der
Sorte ?Niva", um durch Verwendung einer grosseren Zahl von Praparaten die zytologische Forsohung
zu vertiefen. Des Material wurde wiederum auf zweifache Weise verarbeitet, nur erhohte rich die Zahl
der entnommenen and untersuchten Vegetationspunkte auf des Doppelte. Gleichzeitig wurden immer
10 Vegetationspunkte mit dem Gemisch nach Helly (gleicher Vorgang wie i. J. 1954) and 10 Vegetations.
punkte mit dem Gemisch nach Zirkle unter Beiaatz von Formaldehyd (O'Brien 1951) fixiert, and zwar
zum Vergleich beider Fixierungen, da zwischen ihnen ein gewisser Unterschied festzustellen war. Wir
nehmen an, days dieser Unterschied durch des Quecksilber bedingt ist, der die Eiweissstoffe ausfallt.
Die Farbung der Praparate erfolgte mit dem Regaudschen Hamatoxylin, mit einem Gemisch von Hama-
toxylin and Bordeaux R, nach Milovidov (1928), nach Altmann (Romeis 1948) and mit Silberunpragnie-
rung, die t7berfuhrung in Balsam mit Isopropylalkohol and Xylen.
Nach festgestellter t7bereinstimmung der mikroskopischen Dauerpraparate and der Praparate enter
dem Fluoreszenzmikroskop wurde der Versuch so angeordnet, dass die kurz mit dem Fluoreszenz-
mikroskop untersuchten Vegetationspunkte fixiert and aus ihnen farbige Dauerpraparate angefertigt
wurden. Diese Methods ist allerdings derart schwierig, days sie nach Ausscheidung der mechanisch and
durch LTV-Bestrahlung beschadigten Praparate nur in wenigen Fallen erfolgreich war.
Experimentelles
Die im Jahre 1954 begonnenen Versuche an vier Sorten mit verschieden langer
Vegetationsdauer erbrachten folgende Ergebnisse.
Die Sorte ?Niva" besitzt morphologisch gut ausgeglichene Vegetationspunkte,
in denen aber das Chlorophyllvorkommen sehr unregelmassig ist. So macht sich
z. B. am 1. 6. in den Vegetationspunkten eine deutliche Differenzierung der Ahrchen
and eine intensive Rotfluoreszenz fast in der ganzen Achsenlange bemerkbar.
Manchmal sind die Plastiden an der Basis des Vegetationspunktes anwesend, bei
anderen reichen sie bis zur Halfte der Ahrenlange. Daneben kommen aber auch
Vegetationspunkte derselben Serie vor, die zwar gleichfalls Ahrchen aufweisen,
aber unter dem Fluoreszenzmikroskop uberhaupt nicht rot leuchten. In der Serie
vom 5. 6. befand sich gleichfalls ein ziemlich differenzierter, aber nicht rotleuchtender
Vegetationspunkt.
Die. Sorte ,ChlumeckA 12" besitzt morphologisch gut ausgeglichene Vegetations-
punkte mit einem ziemlich regelmassigen Chlorophyllvorkommen, das schon in der
Serie vom 1. 6. deutlich in Erscheinung tritt. Die Serie vom 15. 6. weist bereits eine
Differenzierung der Ahrchenanlagen auf and die Rotfluoreszenz erstreckt sich fast
bis zum Ende des Vegetationspunktes, an dessen Basis Plastiden erscheinen. Alle
Vegetationspunkte mit differenzierten Ahrchenanlagen leuchten rot.
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Bei der Sorte ,Oeska presivka" ist die Entwicklung der Sprossvegetationspunkte
ziemlich unausgeglichen. Die Rotfluoreszenz war erst bei der Serie vom 17. 6. wahr-
nehmbar, wo die Vegetationspunkte in ihrer ganzen Lange rot leuchteten. Bei den
mikroskopischen Dauerpraparaten aus dieser Serie wurden Plastiden bis zu einem
Viertel der Lange des Vegetationspunktes beobachtet.
Die Sorte ,Pozehnani" weist eine ganzlich andersgeartete Entwicklung auf,
da die Vegetationspunkte wahrend der ganzen Versuchsdauer im Zustand der
Ausbildung von Blattanlagen verharrten. Eine Rotfluoreszenz wurde uberhaupt
nicht beobachtet.
Im folgenden Jahre (1955) konzentrierte sich die Forschung auf die Sorte ?Viva",
um die Frage der Plastidenentwicklung eingehender beantworten zu konnen.
Beschreibung der einzelnen Beobachtungen
Die Untersuchung der Vegetationspunkte mit dem Fluoreszenzmikroskop begann
am 20. Tage nach der Aussaat (25. 4.), an dem die Blatter bereits die Koleoptilen
.durchbrochen hatten. Das Leuchten war klar blau. Bei den Dauerpraparaten aus
dieser Serie wurden mitochondriale Strukturen gefunden.
Die zweite Beobachtung erfolgte erst am 2. 5. Die einzelnen Vegetationspunkte
unterscheiden sich voneinander and konnen in drei charakteristische Gruppen ein-
.geteilt werden. In der ersten Gruppe befinden sich solche, die von den ersten Blattern
eingechlossen sind, in der zweiten sind die Blattanlagen auf der sich verlangernden
Achse des Vegetationspunktes sichtbar. Die dritte Gruppe unterscheidet sich von
der zweiten durch eine grossere Verlangerung des Stengels. Die Fluoreszenz ist bei
allen Vegetationspunkten blau. Bei der zytologischen Verarbeitung der Dauer-
praparate wurden Mitochondrien and in zwei Fallen in den Basalzellen des Vegeta-
tionspunktes Gebilde festgestellt, die als Proplastiden angesehen werden konnen.
Die dritte Serie wurde am 4. 5. verarbeitet. Die Vegetationspunkte verlangerten
sich and die Fluoreszenz war bei den einzelnen Vegetationspunkten unterschiedlich,
da these in sechs Fallen klar blau, in drei Fallen an der Basis rot leuchteten. In einem
Falle reichte die Rotfluoreszenz bis zur Halfte der Gesamtlange.
Die Serie des nachstfolgenden Tages (5. 5.) befand sich praktisch auf derselben
Stufe der morphologischen Entwicklung. Fiinf Vegetationspunkte leuchteten klar
blau, bei zweien war ein rotes Leuchten an der Basis bemerkbar, zwei weitere leuch-
teten bis zur Halfte ihrer Lange orange, ein weiterer praktisch in der gleichen Lange
rot. Bei den Dauerpraparaten liessen sich zytologisch charakteristische Mitochon-
drien bestimmen. In einem Falle wurden an der Basis Proplastiden in Form ver-
dickter Stabchen beobachtet. Bei einem Vegetationspunkt wurden Plastiden in den
Zellen ungefahr bis zu seiner halben Lange gefunden.
Die Serie vom 6. 5. war unter dem Fluoreszenzmikroskop ziemlich unausgeglichen.
In sechs Fallen leuchteten die Vegetationspunkte klar blau, in zweien an der Basis
rot and in einem reichte die Rotfluoreszenz bis zu einem Drittel der Lange.
Am 7. 5. war bereits eine wesentliche Verlangerung der Vegetationspunkte
bemerkbar, die wiederum unausgeglichen fluoreszierten, and zwar leuchteten sechs
blau, zwei an der Basis gelborange, einer an der Basis rot and ein weiterer bis zu
einem Drittel der Lange ebenfalls rot. In den basalen Zellen eines Vegetationspunktes
wurden zytologisch hornchenformige Proplastiden festgestellt, bei einem anderen
kamen these Proplastiden in den Zellen eines Drittels der Lange vor.
Bei der Serie vom 8. 5. machte rich bei vier Vegetationspunkten ein gelb-orange-
farbenes Leuchten bemerkbar, ein weiterer leuchtete rot in zwei Dritteln seiner
Lange, zwei fluoreszierten rot in ihrer ganzen Lange and schliesslich zwei andere blau.
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In den Zellen der Dauerpraparate waren Proplastiden von verschiedener Form
wahrnehmbar.
Die Vegetationspunkte vom 9. 5. waxen praktisch in ihrer morphologischen Ent-
wicklung gleichbleibend. In vier Fallen konnte eine Rotfluoreszenz uberhaupt nicht
verzeichnet werden, die ubrigen Vegetationspunkte leuchteten rot, und zwar drei
an der Basis, einer in drei Vierteln der Lange und zwei in der ganzen Lange.
Die zytologische Untersuchung zeigte wie am.Vortage wiederum verschieden ge-
formte Plastiden.
Bei der Serie vom 10. 5. leuchtete ein Vegetationspunkt unter dem Fluoreszenz-
mikroskop iiberhaupt nicht rot, die anderen fluoreszierten rot, davon sechs an der
Basis, zwei ziemlich schwach in zwei Dritteln und einer sehr intensiv in der ganzen
Lange. Die zytologische Untersuchung der Dauerpraparate erbrachte bei dieser
Serie zum ersten Male an der Basis vollig typische Plastidenformen.
Am 11. 5. fluoreszierte ein Vegetationspunkt wiederum nicht rot, sieben schwach
in ihrer ganzen Lange, zwei im gleichen Ausmass sehr intensiv. In den Zellen der
Dauerpraparate konnten an der Basis charakteristische Plastiden, am Ende des
Vegetationspunktes verschieden geformte Proplastiden beobachtet werden (Abb.1).
Bei der Serie vom 12. 5. leuchtete ein Vegetationspunkt nicht rot, die anderen rot,
und zwar zwei an der Basis, drei zur Halite und fiinf intensiv in der ganzen Lange.
Die charakteristischen Plastiden befanden sich an der Basis und riickten von hier
entlang der Sprossachse bis zu einem Drittel der Lange vor.
Am 13. 5. leuchteten rot alle Vegetationspunkte bis zu drei Vierteln der Lange
mit Ausnahme eines einzigen, der nur an der Basis leuchtete. Ein Vegetationspunkt
fluoreszierte uberhaupt nicht rot. Das zytologische Bild war dasselbe wie bei der
Serie des Vortages.
Bei der Serie vom 14. 5. begannen sich bei den Vegetationspunkten Ahrchen-
anlagen (sog. double ridges) zu differenzieren. In vier Fallen konnte eine Rotfluores-
zenz in der ganzen Achsenlange, in zwei Fallen ein schwaches Leuchten in zwei
Dritteln, in zwei weiteren an der Basis beobachtet werden. Das zytologische Bild
blieb im allgemeinen unverandert, nur breiteten sich die fertigen Plastiden big zur
Halfte der Vegetationspunktes aus.
Die Serie vom 16. 5. zeigte unter dem Fluoreszenzmikroskop bei einem Vegeta-
tionspunkt ein gelbes Leuchten in der halben Lange, drei Vegetationspunkte leuch-
teten schwach rot zu drei Vierteln und weitere drei intensiv rot in der ganzen Lange.
In einem Falle erschien eine Rotfluoreszenz auch bei den sich entwickelnden Ahrohen
entlang ihrer Achsen. Typische Plastiden in den Zellen konnten in der ganzen Lange
des Vegetationspunktes beobachtet werden.
Auch bei der Serie vom 18. 5. leuchtete ein Vegetationspunkt nicht rot, ein wei-
terer nur schwach bis zur Halfte; die ubrigen fluoreszierten rot in ihrer ganzen
Achsenlange. Das zytologische Bild war dasselbe wie am Vortag (Abb. 2).
Bei der Serie vom 20. 5. konnte bei alien Vegetationspunkten eine intensive Rot-
fluoreszenz beobachtet werden. In sieben Fallen war eine Zickzackkrammung der
Achse bemerkbar. Bei den zytologischen Praparaten konnten wiederum verschiedene
Plastidenformen in den Zellen der Ahrchenanlagen beobachtet werden.
Die letzte Serie vom 23. 5. enthielt Vegetationspunkte, die in ihrer ganzen Lange
rot fluoreszierten und eine betonte Zickzackkriimmung der Achse aufwiesen. Das
zytologische Bild war mit dem der Serie vom 20. 5. ubereinstimmend (Abb. 7-10).
Ein Vergleich der Beobachtungen unter dem Fluoreszenzmikroskop mit dem glei-
chen fixierten 'und gefarbten Praparat bestatigte unsere fruheren Befunde bei
Praparaten derselben Serie. Das zytologische Bild ist allerdings unmerklich gestort,
sodass sich teilweise eine Verklumpung der Mitochondrien und Plastiden bemerkbar
macht, die etwas an die Fixierung nach Helly erinnert. An der Achse ist in der Hohe
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der ersten Blattanlage zum Unterschied von den Mitochondrien eine Verdickung
der Plastiden bemerkbar. Das Chlorophyllvorkommen in diesem Zeitpunkt diirfte
den Befunden von Alvarado (1923), Jutta von Loui (1930), Guilliermond (1941)
and Strugger (1950) entsprechen.
Diskussion and Zusammen f assung
Abschliessend kann gesagt werden, dass wir irgendeinen einfachen Zusammenhang
zwischen dem morphologischen Zustand des Vegetationspunktes and dem Chloro-
phyllvorkommen nicht feststellen konnten, wie dies vielleicht auf den ersten Blick
vorausgesetzt werden konnte. Zwar rind in der Mehrzahl der Falle die Vegetations-
punkte bereits zur Zeit der Differenzierung der Ahrchenanlagen chlorophyllhaltig,
doch fanden wir, besonders bei der Sorte Niva, auch Ausnahmen. Diese Tatsache
weist darauf hin, dass die Beziehung zwischen dem Erscheinen des Chlorophylls
and der weiteren Entwicklung der Ahre nicht so einfach ist, wie Melnikov (1936, zit.
nach Gjubbenet 1953) annahm. Seiner Ansicht nach musste das Chlorophyll in den
Vegetationspunkten immer bereits vor Differenzierung der Ahrchenanlagen enthalten
sein. Andererseits kommt dem Chlorophyll in der Entwicklung des Vegetations-
punktes eine zweifellos wesentliche Bedeutung zu, wie bei der Sorte ?Pozehnana"
gezeigt wurde, wo in keinem einzigen Falle Chlorophyll in den Vegetationspunkten
nachgewiesen werden konnte. Daraus kann auf eine weitaus breitere Einbeziehung
der Chloroplasten in den gesamten Stoffwechsel geschlossen werden.
Bemerkenswert ist die Unausgeglichenheit der Rotfluoreszenz bei den einzelnen
Vegetationspunkten derselben Serie. Man konnte annehmen, dass dies durch die
geringe Zahl der untersuchten Individuen (n) verursacht ist, doch es verhalt sich
nicht so. Abgesehen davon, dass die anspruchsvolle Methodik die Verarbeitung einer
grosseren Zahl nicht zulasst, ist dies auch fur die Zwecke einer zytologischen Unter-
suchung gar nicht notwendig. Das Kriterium der Ausgeglichenheit bildete der
anatomisch-morphologische Zustand der Vegetationspunkte. Experimental wurde
festgestellt, dass die Zahl der untersuchten Vegetationspunkte zur Geniige die
morphologische Variationsbreite erfasste. Die fortlaufende Beobachtung and Kon-
trolle schliesst auch eine Verursachung der Unausgeglichenheit durch okologische
Faktoren aus. Wird in Betracht gezogen, dass die Vegetationspunkte bei einer
morphologischen Unausgeglichenheit auch eine Unausgeglichenheit der Fluoreszenz-
strahlung aufweisen, so lasst dies auf ein kompliziertes physiologisches Geschehen
schliessen, das eine spezielle Forschung notwendig erscheinen lasst.
Die zytologische Untersuchung der Chloroplastenentwicklung in der vorliegenden
Arbeit ist eine einleitende Studie zur Genetik der Plastiden (Newcomer 1940, 1951,
Weier-Stocking 1938, 1952, Correns and Wettstein 1937). Das Studium der
panaschierten Pflanzen verweist auf eine genetische Kontinuitat der Plastiden
sowohl in den mannlichen als auch weiblichen Reproduktionszellen (Michaelis 1954,
1955a, 1955b, Ruhland and Wetzel 1924). Die Frage der Kontinuitat der Plastiden
ist aber oft verbunden mit der Frage des Ursprungs der Plastiden and ihrer Ent-
wicklung (Lewitsky 1911, Schimper 1883, Mevius and Duvel 1954). Einige Autoren
(Guilliermond 1941, Rezende-Pinto 1952, O'Brien 1951, Sorokin 1941, 1955, Strug-
ger 1951, 1954a, b, Kaja 1954, Grave 1954) bemuhten sich, unter Anwendung
verschiedener Methoden einen Unterschied zwischen Mitochondrien and Proplastiden
zu finden. Diese methodisch sehr schwierige Unterscheidung ist aber letzten Endes
vom Gesichtspunkt der Kontinuitat der Plastiden aus gesehen unwesentlich, da
unserer Meinung nach die Proplastiden Partikel sui generis von spezifischer Charakte-
ristik sind.
(Bildtafeln XLI, XLII)
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FOLIA BIOLOGICA
Untersuchungen mitochondrialer Strukturen bei Reis and Weizen
1. HRAEL
Biologieches Institut der Techal. Akademie der Wiasensohaften, Abteilung fir Pflanzenphysiologie,
Praha
Die Befunde von enzymatischen Atmungssystemen and ihr Zusammenhang mit
photosynthetischen Prozessen veranlassten ens zum Studium der mitochondrialen
Strukturen in den sich entwickelnden Reis- and Weizenzellen.
Bei den Untersuohungen am keimenden Reis wurde die Fixierung nach Belly mit 36stdndiger Chro-
mierung der Mitochondrien in gesllttigtem Kaliumbichromat (Baker 1951) durchgefuhrt. Ale Farbungs-
mittel dienten Eisenhamatoaylin nach Regaud, Kristallviolett nach Benda, Anilm1ichtgrdn nach
Harman (1950). Die Untersoheidung der Mitochondrien and Polysaccharide erfolgte mit der von Milo-
vidov (1928) empfohlenen Farbungsmethode, die Bestimmung von Lipiden nach Ciaccio-Lison unter
Beniitzung von Paraffinachnitten durch Farbung mit Sudanschwarz (Fettschwarz ,Geigy"-Lison 1936).
Fair die Reaktion auf Polysaccharide wurde Perjodsaure-Schiffsohes Reagens (Mc Manus and Cason 1950)
and die Farbung mit Tenpin-Eisenalaun nach Salazar (Wallraff 1951) bendtzt. Zu Vergleiohszwecken
wurden auch Untersuchungen in vivo angestellt and beim Weizen die Fiaierung nach Erliki-Zirkle, ale
1berfiihrungsmittel tertiares Butanol and als FArbungemittel Eisenhamatoxylin nach Regaud, Sudan-
schwarz and Altmannsches Saurefuohein-Tannin-Methylgrf n (Milovidov 1928) verwendet.
Ergebnisse
Unsere Untersuchungen an dem unter verschiedenen physiologischen Bedingungen
(enter Wasser, in feuchtem Milieu, im Dunkeln and im Licht) keimenden Reis im
Verlauf der ersten acht Tage haben gezeigt, days die mitochondrialen Strukturenauf
anaerobe and aerobe Bedingungen reagieren. Von normalen Verhaltnissen (teilweise
enter Wasser geziichteter Reis) am unterschiedlichsten verlief die Entwicklung bei
den im Dunkeln enter Wasser gezogenen Keimlingen. Die mitochondrialen Elemente
waren in ihrer Entwicklung zu Plastiden stark verspatet and erreichten nur das
Aussehen hantelformiger Gebilde. Das Zytoplasma der Zelle war stark vakuolisiert
and in den Vakuolen eine Vermehrung der Eisweisskorperchen, der sog. Spharo-
plasten (HrAel 1955) zu beobachten, die sichtlich die mitochondrialen Plastiden
ersetzten. In der Blattzelle, die normal aus mitochondrialen Strukturen hervor-
gegangene Plastiden besitzt, befinden sich nur ein oder zwei Spharoplasten, die
machmal auch zerfallen. Die zu den Spharoplasten and zu den Strukturen der Golgi-
Zone gehorenden Elemente wurden erstmalig von Nemec (1901) als sogenannte
centrosomahnliche Gebilde beobachtet.
Die ersten Phasen der Plastidenentwicklung verlaufen beim Reis fiber kugelige
Mitochondrien (mitochondria), die auf kappenartige vakuolare oder zytoplasma-
tische Gebilde aufsitzen. Diese Gebilde befinden rich in unmittelbarer Nahe des
Kerns and wurden gleichfalls von Nemec (1901) beschrieben. Unseren Beobachtungen
nach zu schliessen, gehoren sie ebenfalls zu den Strukturen der Golgi-Zone. Die
Mitochondrien dehnen sich centrodesmoseahnlich aus, teilen and vergrossern sich
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and schreiten in ihrer Umwandlung zu Plastiden fort. Nach Steiner (1954) sind die stab-
chenartigen Formen der Mitochondrien in der Phase der Eiweisssynthese anwesend.
Beim Weizen wurde das Verhalten mitochondrialer Strukturen im Verlauf der
ersten Keimungsphasen durch 48 Stunden hindurch beobachtet. Eine Stunde
nach Beginn der Ankeimung wurden im. Zytoplasma der Zellen des Vegetations-
punktes sowie des ersten and zweiten Blattes ungleich grosse, mit Saure-
fuchsin nach Altmann and Eisenhamytoxylin farbbare Kornchen festgestellt,
die im weiteren Verlauf, d. i. 2 Stunden nach dem Ankeimungsbeginn,
bis auf 1-3 der grossten Kornchen im Vegetationspunkt verschwinden. Ansonsten
enthalt das Zytoplasma keine sichtbare Inklusionen. Nach weiteren 36 Stunden
erscheinen im Zytoplasma des Vegetationspunktes and des ersten and zweiten
Blattes an der Grenze der Sichtbarkeit eine Menge mikrosomatischer Grana, die sich
ausdehnen, vergrossern and faserige Mitochondrien ausbilden and Bich dann weiter
zu Plastiden differenzieren. Im dritten Blatt sind die Plastidenanlagen bei der
Ankeimung fertig and - ahnlich wie Beim Reis - in der Golgi-Zone auf dem zyto-
plasmatischen and vakuolaren Gebilde in der Nahe des Kerns konzentriert. O'Brien
(1942, 1951) beschreibt these Gebilde als sogenannte Aggregationsmasse, aus der sich
im Verlaufe der weiteren Entwicklung die Plastiden loslosen and im ganzen Zyto-
plasma ausbreiten. Das angehaufte Zytoplasma differenziert sich spater sichtlich
zu Spharoplasten. Die in den Zellen unmittelbar nach der Ankeimung (1 his 11 Stun-
den) beschriebenen Kornchen erachten wir als mitochondriales ergastisches Material,
da sie in der stimulierten (d. i.. excitierten) Zelle verschwinden. Dieses ergastische
Material enthalt wahrscheinlich Eiweissstoffe, die vom Grundzytoplasma bei Ent-
wicklung der Mitochondrien verbraucht werden. Das Zytoplasma farbt sich un-
mittelbar vor and bei dem Erscheinen der mikrosomatischen Gebilde mit Hama-
toxylinpraparaten dunkel. Die Zellen unterhalb des Vegetationspunktes enthalten
in grosserer Mengen Aleuronkorner, die mit Saurefuchsin nach Altmann and Eisen-
hamatoxylin farbbar sind, spater vakuolisieren and in kleine, granaahnliche Mito-
chondrien zerfallen. Die Vakuolen enthalten Fettstoffe, die durch Farbung mit
Sudanschwarz nachgewiesen werden, and auch der Vegetationspunkt ist reich
an fettartigen Stoffen, woraus auf die Moglichkeit einer Teilnahme mitochondrialer
Strukturen an der Fettstoffbildung geschlossen werden kann.
Die Aleuronkorner in den Scutellarzellen enthalten Vakuole mit Polysaccharid-
inklusionen, wie mit der Farbung nach Milovodov festgestellt wurde. Die Zellen des
Scutellarepithels weisen 1 bis 2 Stunden nach dem Ankeimungsbeginn kleine kuge-
lige Mitochondrien auf, die sich vergrossern and 11 Stunden nach dem Ankeimungs-
beginn stellenweise die Grosse von Aleuronkornern erreichen. Spater zerfallen sie
wieder. Die Zellen des Scutellarepithels enthalten eine Menge von Fettstoffen, the
Aleuronkorner des Scutellarepithels gleichfalls Vakuolen mit Polysaccharidin-
klusionen, die auch frei im Zytoplasma gelagert rind. Der Charakter der Aleuronkorner
im Scutellum and Scutellarepithel beim Weizen weist auf ihren mitochondrialen
Ursprung bin, der auch durch ihre Farbbarkeit mit Janusgrun unterstritzt wird.
Guilliermond (1941) leitet the Aleuronkorner vom Kolloidgehalt der Vakuolen ab,
eine Annahme, die mit der haufigen Vakuolisierung der Mitochondrien and Aleuron-
korner erklart werden kann. Die Aleuronkorner im Scutellum and Scutellarepithel
sind sichtlich an der Vberfiihrung der Polysaccharide aus dem Endosperm in den
Keim beteiligt, bei der anscheinend auch bestimmte Koazervationsprozesse eine
wichtige Rolle spielen. Die Anschauungen einiger Autoren (Horning 1933) von der
Diastasefahigkeit der Mitochondrien im Scutellum and Scutellarepithel and ihrer
Beteiligung an der Polysaccharidversorgung des Keims werden durch unsere Ver-
suche unterstiltzt. Die inneren Endospermzellen enthalten zu Beginn ihrer Ent-
wicklung sehr kleine mikrosomatische Gebilde, die sich unter dem optischen Mikro-
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skop an der Grenze der Sichtbarkeit befinden. In den Endospermzellen hebt Bich
gut die Grundstruktur des Zytoplasmas, also die mikrosomatischen, durch Faden
verbundenen Gebilde hervor. Eine ahnliche Beobachtung machte auch Duvick (1955).
Ausser den mikrosomatischen mitochondrialen Strukturen Sind im Zytoplasma
ebenso kleine Grana vorhanden, die mit Tannin-Methylgriin nach Milovidov farbbar
sind, sich vergrossern and zu Starkekornern anwachsen. Ob sich these Grana unter
Teilnahme mikrosomatischer mitochondrialer Strukturen bilden oder ob sie selb-
standige Gebilde vom Charakter der Glykoproteine rind, kann vorlaufig nicht mit
Bestimmtheit gesagt werden. In den Randzellen der Aleurone des Endosperms
stellen wir ubereinstimmend mit Mottier (1921) bereits stabchen- and fadenartige
mitochondriale Gebilde, stellenweise aucl-junge Plastiden ahnlich jenen in den
Blattzellen fest, doch ist ihre Farbbarkeit weitaus weniger intensiv. Sie vakuolisieren
oft Behr stark and nehmen eine kugelige Form an.
Diekusaion
Auf Grund unserer Beobachtungen and der heutigen Ansichten fiber die Mito-
chondrion konnen wir nun die Aufgabe and Funktion der Mitochondrien im Pflanzen-
organismus andeuten. Nach Millerd and Bonner (1953) ermoglicht der Fortschritt
in der Kenntnis von den Funktionen der pflanzlichen Mitoohondrien einen tieferen
Einblick in den gesamten Charakter des Pflanzenorganismus. Insbesonders gilt
dies fur die mit der Atmung der Pflanzen verbundenen physiologischen Prozesse.
Pflanzliche Gewebe oder Organe, die an bestimmten biologischen Schopfungs-
prozessen beteiligt sind, atmen bekanntlich intensiver als dieselben Organs im
Ruhezustand. Die enzymatischen Systems vermitteln die Vberfuhrung der in den
Mitochondrien enthaltenen Phosphate and rind daher vor allem an den Oxydations-
und Phosphorylationsprozessen beteiligt. Unsere Beobachtungen unterstiitzten
die Ansichten fiber die Beziehung der Mitochondrien zum Umsatz der Zucker and
Fettatoffe in den keimenden Pflanzen Bowie im entstehenden Endosperm and stimmen
gleichfalls mit den Ansichten caber die Regulationsfunktion der Mitochondrien in
den grundlegenden Prozessen der physiologischen Aktivitat iiberein. Die Um-
wandlung von Starke in losliche Zucker vom Pektintypus, der Transport
der Pektinsubstanzen in den Keim, die Ablagerung and Bildung von Fettstoffen
and Starke im Endosperm gehoren zu jenem physiologischen Geschehen, das von
den Phosphorylationsprozessen der Mitochondrien geleitet and reguliert wird. Die
Kenntnisse von den Eiweisastoffen and Lipiden der Mitochondrien and anderen
Elemente sind allerdings noch Behr unvollkommen. Die Feststellung bestimmter
enzymatischer Systeme in den Mitochondrien bewirkte, lass samtliche enzymatischen
Gewebsfunktionen zu Unrecht ausschliesslich den Mitochondrien zugeschrieben
wurden (Schneider 1953). Die zytoplasmatiache mikrosomatische Struktur umfasst
gleichfalls Enzyme der Atmungsvorgange, da auch nach Beseitigung der Mito-
chondrien die Atmung des Zytoplasmas, auoh wenn bereits weniger intensiv als bei
ihrer Anwesenheit, nicht aufhort (Literatur hieruber siehe bei Monne and Harde
1952). Es soheint, dass die Mitoohondrien die Zentren wichtiger Atmungs- and
anderer Enzyme Sind, the vom Zytoplasma aufgebaut werden and im Verlaufe der
Zellentwicklung die physiologische Regulation der Zellen ubernehmen.
Auf Grund der angefuhrten Erkenntmsse konnen wir, in Ubereinstimmung mit
Cowdry (1953), die Mitochondrien folgend charakterisieren: 1. Sie sind die Grund-
elemente des Zellzytoplasmas. 2. Sie besitzen eine umfangreiche Oberflache, die eine
Bute Beruhrung mit dem umgebenden Zytoplasma ermoglichen. 3. Sie Bind aus
Lipoprotein zusammengesetzt. 4. Sie sind Zentren des schopferischen Metabolismus,
kleine Einrichtungen, die viele fiir die Zelle lebenanotwendige Produkte erzeugen.
(Bildtafein XLIII, XLIV, XLV, XLVI)
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Pe31o.aee
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(Ta6n. XLIII, XLIV, XLV, XL VI)
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Tom. II. (1956) - Faso. 6
Die Feststellung der Lebensfahigkeit von Mutterkornpilzkonidien
mittels Vitalfarbungsmethode
P. MILOVIDOV
Forschungsinstitut fur Hellpfanzen, Praha
Die Wirksamkeit von Mutterkornpilz-Impfsuspensionen, in denen lebende Koni-
dien ein wesentliches Element vorstellen, wurde bisher mit einer ziemlich arbeits-
reichen and langwierigen Methode kontrolliert, die in der Feststellung der Keim-
fahigkeit von Konidien auf festen Nahrboden in Petri-Schalen bestand (Kybal and
Vavrou?kova 1955). Ich habe daher eine Farbungsmethode der Mutterkornpilz-
konidien mit Neutralrot ausgearbeitet, die eine schnelle Orientierung and sogar
eine ziemlich genaue Bestimmung des Prozentsatzes lebender Konidien bei ver-
schiedenen in der Praxis verwendeten Impfstoffen ermoglicht. Diese Methode, die
gegenuber dem herkommlichen Untersuchungsmodus eine Reihe von Vorteilen auf-
zuweisen hat, sti tzt sich auf die bekannte Erfahrung, Bass das Neutralrot in der
lebenden Pflanzenzelle nur die Elemente des Vakuoms farbt (P. A. and P. Dangeard
1919, 1923a, b, Guilliermond 1927, 1929a, b, 1930).
Experimentellea
Es wurden 30 Standardversuche mit drei Mutterkornpilz-Impfstoffarten vorgenommen, and zwar
mit den in Reagensglasern auf Agar gezuchteten Kulturen, mit getrocknetem Material and mit Kulturen,
die rich in Flaschen auf Roggenkorn-Substrat entwickelten. Untersuoht wurden Ergotoxin- and
Ergotaminkulturen, gemischte, gewohnliche and Monokonidienkulturen, and zwar sowohl vollig gesunde
and gut entwickelte als such unentwickelte oder Behr alto, manchmal such kontaminierte Kulturen im
Alter von 36 bis 222 Tagen (siehe Tab. I). In einem Versuch wurden annahernd 200 bis 1000 Konidien
gezahlt. Die Verdunnung betrug bei dem Trockenmaterial (100 g) 50 bis 100 1, bei den auf Agar gezuch-
teten Kulturen 100 ml oder mehr, bei den Flaschen-Kulturen 100 1; im allgemeinen wurde sie aber
so gewahlt, dass eine Suspensionskonzentration von 4-5 Konidien in einem Rechteck der Burkerschen
Zahlkammer erzielt wurde.
Die Farbung erfolgte durch Beigabe von 25 mg Farbstoff in substantia in 50 ml Konidien-
suspension (= 0,05%-ige Losung), die ungefahr 5 Min. geschuttelt and 3-4 Stunden (manohmal such
weniger) ureter Laboratoriumstemperatur stehen gelassen wurde. Vor Gebrauch wurde dann die Sus-
pension neuerlich geschiittelt and in die Burkerache Zahlkammer eingebracht. Gezahlt warden regel-
massig 100 Rechtecke in 4 Feldern (2 x 2), wobei such tote Konidien beachtet wurden, sodass sich
sowohl der Prozentsatz als such die Gesamtzahl der lebenden Konidien im gepruften Muster leicht fest-
stellenliess. Ein Teil der Konidien wurde zur Parallelbestimmung der Keimungsfahigkeit nach den Grund-
satzen der bisherigen Methode (Kybal, Vavroubkovb, 1955) verwendet. Die in % festgestellten Maximal-
Die von einer eingearbeiteten Kraft zur Durchfdhrung eines Versuchs nach dieser Methode benotigte
Zeit betragt ungefahr einen halben Tag (5 Stunden), wahrend die bisherige Methode mindestens 3 Tage
erforderte. Die eigentliche zahlenmassige Bestimmung von lebenden Konidien ureter dem Mi-
kroskop dauert ungefahr % Stunde. Die neue Methode ist also bedeutend kiirzer, einfaoher and zur
Bestirnmung der Zahl lebender Konidien in der Kultur geeignet. Sie ist such billiger, do die Verwendung
von Agar ausfallt.
In vereinzelten Fallen kommt es vor, class die Farbung der Konidien mit Neutralrot such nach
3-4 Stunden, manchmal such nach 24 Stunden unzureichend ist and days rich die Konidien erst nach
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Beigabe einer weiteren Menge des Farbungsmittels (Konzentrationserhohung) zu farben beginner.
Das hauptsachlichste Hindernis besteht darin, dass der Farbstoff von den Agarteilchen absorbiert wird,
die wahrend der Suspensionszubereitung beim Passieren des Inhaltes der Reagensglaser in das Wasser
gelangen, wodurch die Farbung der Objekte vereitelt wird.
Die Farbbarkeit der Konidien steigt, wenn these von dem Agar vorsichtig abgekratzt and mit Wasser
abgespult werden. Bei diesem Verarbeitungsmodus farben sich die Konidien optimal bereits nach
1 Stunde.
Ergebnis8e and Diskussion
Die Neutralrotlosung farbt, wie bekannt, in den lebenden Zellen das Vakuolen-
system diffus rosa oder bringt in den Vakuolen rot gefarbte Kornchen zum Nieder-
schlag. Diese Farbung ist fur den Vakuoleninhalt elektiv, da sich weder das Zyto-
plasma noch der Zellkern fabbt. Manchmal farbt sich in den Vakuolen sowohl ihr
Inhalt (rosa) als auch die Kornchen (rot) (vgl. Guilliermond). Dagegen tritt in den
Ver-
suchs-
zahl
Art des
Alka-
loids
Art des Ausgangs-
materials fur
Impfstoffe
Alter der
Kultur
in Tagen
Prozentsatz
der lebenden
Konidien
Prozentsatz
der
keimenden
Konidien
Unterschied
zwischen
beiden
Methoden
in %
1
Ex
Roggenkorn-Pilzkultur
36
85,3
88,3
- 3,0
2
Em
?
45
76,3
65,1
+ 11,2
3
Ex
?
48
74,0
71,8
+ 2,2
4
Ex
?
48
81,7
81,5
+ 0,2
5
Em
?
55
68,4
66,2
+ 2,2
6
Ex
?
78
71,11)
78,4
- 7,3
7
Ex
?
84
71,5
71,1
+ 0,4
8
Ex
?
87
66,2
75,2
- 9,0
9
Em
?
98
46,0
39,4
+ 6,6
10
Ex
?
106
39,22)
45,4
- 6,2
11
Em
?
110
12,5
7,4
+ 5,1
12
Em
118
2,9
3,6
- 0,7
13
Ex
Roggenkorn-Pilzkultur
62
72,2
66,53)
+ 5,7
14
Ex
?
73
48,4
62,9
- 14,4
15
Ex
?
80
66,0
63,0
+ 3,0
16
Ex
?
183
13,5
12,5
+ 1,0
17
Ex
222
5,2
einzeln
+ 5,2
18
Ex
Agar-Pilzkultur
40
83,8
81,5
+ 2,3
19
Ex
?
44
91,7
84,4
+ 7,3
20
Em
?
49
77,24)
76,3
+ 0,9
21
gemischt
?
51
88,73)
80,2
+ 8,5
22
Em
,
65
78,0
70,6
+ 7,4
23
Ex
?
80
72,2
74,5
- 2,3
24
Ex
?
83
71,2
77,3
- 6,1
25
Em
?
86
74,1
73,5
+ 0,6
26
Ex
?
91
59,1
63,5
- 4,4
27
gemischt
?
97
65,0
65,4
- 0,4
28
Ex
?
105
56,7
70,7
- 14,0
29
gemischt
?
103
71,3
70,6
+ 0,7
30
Ex
?
111
76,1
7,2
- 0,1
Arithmetischer Gesamtdurchschnitt + 4,8
Bemerkung: 1) Durchschnitt aus 5 Bestimmungen; 2) Durchschnitt aus 3 Bestimmungen; 3) Durchschnitt
aus 2 Bestimmungen; 4) Durchschnitt aus 2 Angaben nach zwei Farbungsmethoden. Ex = Ergo-
toxin; Em = Ergotamin.
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beschadigten and absterbenden Zellen eine Inversion der Farbung ein; das Vakuolen-
system wird entfarbt, wahrend sich Zellkern and Zytoplasma intensiv farben and
die Strukturen im Zellkern sichtbar werden. Tote Konidien farben sich zur Gauze
and intensiv; sie sind zusammengeschrumpft. Langst abgestorbene (leere) Konidien
farben sich nicht mehr. In Standardsuspensionen ist zu ersehen, dass bei lebenden
Konidien sich nur die Vakuoleninklusionen (eine oder mehrere) rot farben, die
gewohnlich die typische Brownsche Molekularbewegung aufweisen. Wahrend der
Beobachtung sterben dann einige Konidien ab, wobei die erwahnte Farbungs-
inversion eintritt. Auch keimende Konidien nehmen die Farbe sehr gut an, and die
farbigen Kornchen sind dann sowohl in der Spore selbst als such im Keim and darn
im Fadenmyzel sichtbar.
In sehr alten Kulturen (bis zu 1 Jahr) farben sich lediglich vereinzelte Zellen oder
such besonders grosse, auf den Hyphen entstandene Gebilde, gewissermassen
,,Dauersporen", die aber keine besonders dicke Membran besitzen. Auch in diesen
spharischen Gebilden farben sich die Korner and es handelt sich also um lebende
Zellen. Das Uberleben solcher grossen kugeligen Sporen in alten Kulturen entspricht
der Erfahrung, dass aus solchen Kulturen vereinzelte Konidien keimen konnen.
Sie verdienen als Entwicklungsstadium des Pilzes Aufmerksamkeit, dessen Zweck
die Arterhaltung unter ungiinstigen Bedingungen ist. In einigen Konidien sind neben
rot gefarbten Kornchen noch stark lichtbrechende runde Korperchen zu finden,
deren chemischer Charakter unbekannt ist and die moglicherweise als Riboflavin
angesprochen werden kann, das bei Pilzen sehr verbreitet ist. Diese tropfenartigen
Korperchen werden nach Farbung mit Neutralrot (und auch mit Methylenblau)
afters gelb bis rotgelb. Es tritt eine Doppelfarbung ein: der Vakuoleninhalt farbt
sich diffus rosa oder die Farbung lokalisiert sich in den Kornchen, wahrend das
zweite tropfenartige Korperchen gelb wird.
Die Zahl der lebenden, mit Neutralrot gefarbten Konidien erreicht ihr Optimum
ungefahr zwischen der 2. and 4. Stunde and sinkt stark nach der 24. Stunde. Es be-
stehen jedoch Ausnahmen; besonders bei den auf andere Weise verarbeiteten Agar-
kulturen.
Aus den in Tabelle I angefiihrten Versuchsangaben ist zu ersehen, dass die mini-
male Abweichung im Vergleich zu der alten Methode - 0,1%, die maximale dann
- 14,4 % (kontaminierte Kultur) oder + 11,2 % (gesunde Kultur) betragt. Der
Gesamtdurchschnitt aus allen 30 Versuchen betragt ? 4,6 %, iibersteigt also nicht
5,0 %. Die Genauigkeit dieser schnellen Methode ist also hinreichend gross and die
erzielten Ergebnisse entsprechen vollauf den Ergebnissen, die mit der bisherigen
Methode zur Feststellung der Keimfahigkeit gewonnen wurden. Einen grossen
Nachteil bedeutet das Fehlen einer verlasslichen Vergleichsmethode, da die Keim-
methode, obzwar grundsatzlich sehr gut, in praktischer Hinsicht aus mehreren
Grunden nicht als genau anzusehen ist. 1. Die keimenden Konidien werden auf
2 Agarplatten in Petri-Schalen gezahlt, and zwar bei jeder an 20 Stellen. Diese
Stellen enthalten nicht selten nur sehr wenige Konidien, sodass die Gesamtzahl der
Konidien vollig unzureichend ist. Ausserdem sind these Konidiengruppen auf der
Platte gewohnlich sehr ungleichmassig verteilt (Klumpenbildung). 2. Die Endzahl
der auskeimenden Konidien ist in der Regel niemals bekannt, da die Agarplatte,
besonders gegen Versuchsende zu (am 3.-4. Tag, manchmal noch friiher), sehr stark
von Pilzhyphen iiberwuchert ist and die genaue Bestimmung der Zahl von keimenden
Konidien dadurch unmoglich gemacht wird. Die Endzahl muss daher entweder
annahernd geschatzt werden, was vollig ungenau ist, oder es wird die zuletzt fest-
gestellte genaue Zahl als endgiiltige Zahl angesehen. Wir haben in der Regel these
zweite Moglichkeit beniitzt.
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Aus dem oben gesagten schliessen wir, dass die Methode der Farbung von Koni-
dien in vivo mit Neutralrot entweder mit 0,05 %-iger Wasserlosung (Gesamtkonzentra-
tion der Suspension) oder mit dem der Suspension beigegebenen Farbstoff in sub-
stantia gute Ergebnisse bringt and zur Orientierung sowie auch zu einer genaueren
Feststellung der Zahl von lebenden Konidien im Impfstoffe empfohlen werden kann.
Zusammen f assung
Per Verfasser beschreibt eine von ihm ausgearbeitete schnelle Methode zur Fest-
stellung der Zahl von lebenden Konidien in verschiedenen Arten von Mutterkornpilz-
Impfstoffen zum Zwecke ihrer Wirksamkeitsbestimmung. Die einfache and sehr
schnelle Methode ist auf der Moglichkeit aufgebaut, lebende Konidien in der Sus-
pension durch Vitalfarbung mit Neutralrot unterscheiden zu konnen. Das Neutralrot
farbt in den lebenden Konidien den gesamten Vakuoleninhalt diffus rosa and die
Vakuolenkorperchen elektiv rot. In toten Zellen farben rich distinkt das ganze
Zytoplasma and der Zellkern mit seinen Strukturen; die Zelle schrumpft zusammen.
Die optimale Dauer der Farbung mit 0,05%-iger Farbstofflosung betragt 3 bis
4 Stunden. Nach 24 Stunden nimmt die Zahl von lebenden Konidien in der Sus-
pension stark ab. Die Angaben der neuen and der bisher angewandten Methode caber
die Zahl von keimenden Konidien differieren um weniger als 5 % (Mittelwert aus
30 Versuchen). In Behr alten Pilzkulturen wurden besondere Gebilde gefunden,
die sich an den Pilzhyphen bilden (,,Dauersporen"), typisch mit Neutralrot farben
and lebendig sind. Ihre Anwesenheit gibt eine Erklarung fur die Moglichkeit, aus
sehr alten Kulturen ein neues Myzel kultivieren zu konnen.
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M. Doatcilek and M. ,9purny: Cultivation Characteristics of sulphate-reducing
Bacteria.
114 kolv~'
Fig. 1. Colony of sulphate-reducing bacteria on thigmotaxic ftln cultivation.
Stain - carbolfuchsin, magnificat ,i
Fig. 2. Bacteria of genus Dosulfovibrio from 24-hour culture in lact'NFIM
carbolfnehsin stain, magnification t1,
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if. 1)ostblek and if. Sjmrncj: Cultivation Characteristics of Suphate- reducing
Bacteria.
Fig. 3. Sporulating Gram negative accompanying bacteria from cultures of sulphate-reducing bacteria.
Lactate agar. Stain - carbolfuchsin, magnification 1,000.
Fig. 4. Coccoid Gram positive accompanying bacteria from culture of sulphate-reducing bacteria. Lactatc-
agar. Stain - carbolfuchsin, magnification 1,800.
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Abb. 1. N. tabacum Samsun, systemisch erkrankt an einem VTM AL-Stamm. Versuchsjahr 1955.
Abb. 2. N. tabacum Samsun, systemisch erkrankt an einem VTM S-Stamm. Versuchsjahr 1955.
Abb. 3. N. tabacum Samsun, systemisch erkrankt an einem VTM Typ-Stamm. Versuchsjahr 1955.
Blatter schwach dekoloriert, stark deformiert and verbeult.
Abb. 4. N. tabacum Samsun. Die an einem VTM S-Stamm systemisch erkrankte Pflanze wurde spater
mit VTM Typ geimpft. Die fiir den VTM S-Stamm charakteristischen Symptome an den unteren Blattern
treten allmahlich bei den weiteren Blattern zurfick, wahrend die Symptome des VTM Typ-Stammes
iiberhandnehmen. An den jfingsten Blattern erscheinen nur noch die Symptome des VTM Typ-Stammes.
Versuchsjahr 1955.
Abb. 5. N. tabacum Goldener Virginier. Die an einem VTM Typ-Stamm systemisch erkrankte Pflanze
wurde spater mit VTM AL geimpft. Symptome der Anwesenheit beider Stamme (Deformationen,
Dekolorationen) sind auch an den jUngsten Blattern wahrnehmbar. Versuchsjahr 1954.
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Abb. 6. N. tabacurn Samsun. Die mit VTM AL iufizierte Pfla.nre w111-de vor Manifestation der 8ymptonm-
snit VTM Typ geimpft. DerVTMAL-Stamm wurde durch den VTM Typ-Stainm sohcinbar ..verdrangt"..
die jiingsten Blatter sind ohne Dekolorationen. ledoch deformiert. Versuehs.jahr 195.5.
Abb. 7. N. tabacum Samsun. Die Pflanze snit Initialsymptornen einer systeniisehen Erkrankung an
VTM AL wurde mit VTM Typ geimpft. Der VTM A L-Stamm wurde dureh den VTM 'I'yp-Stamni
soheinbar ?verdrangt", die jiingsten Blatter sind ohne Dekolorationen, jedoch deformiert. Versuchsjahr-
1955.
Abb. III. ahnlicher Fall wie auf Abb. 9. Die Symptome der Anwesenheit des VT -11 A I -Stannnes rind
Behr schwach, der VTM Ty-p-Stanun macht sich lurch starke Deformationen and Behr selm-m-he Dekolo-
ration bemerkbar. Die ..Verdriingung- ist ehenfalls nur ..scheinbar". Versaclisjahr 1955.
.abb. 8. N. tabacum Samsun. Die an eineui VTM AL-Stannn systemisch crkrankte Pflanze wurde nach-
traglieh mit einom VTM Typ-Stamen geimpft. VTM AL ist scheinbar dureh VTM'I'yp ..verdrangt-:
die iilteren Batter mit typischen Symptornen des VTMAL-Stannnes rind stark dekoloriert, die,jiingsten
Blatter deformiert, aber nur sehr schwach entfdrbt. Versuchs.jahr 19+5:5.
Abb. 9. A". tabacum Samsun. Mit einem Geinisch von VTM Typ and VTMAL geimpfte Ptlaoze. 1)i(-
typischen, Ober no Vergleioh zu den nur mit VTM AL geimpften Kontrollen sehwacheren Symptonie
des V'I'M AL-Stannnes treten auf den jiingsten Slattern allmahlieh zurto k. Der V'I'M Typ-Stannu
herrseht vor, der VTM AL-Starnm ist soheinhar ..verdrangt". Versuehslahr 1955.
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V. Sosnovtt Anatomisch?zytologische Studie fiber die Plastiden
der Vegetationspunkte.
Abb. 1. 2. Der Vegetationspunkt bei Triticum vulgare, Sorte Niva, vom 11. 5. (1) and 18. 5. (2). Fixiert
nach Zirkle-Formol, gefarbt mit dem Regaudschen Hamatoxylin. Vergross. 85 x.
.Abb. 3-6. Die Fntwicklung der Plastiden. Fixiert nach Zirkle-Formol, gefarbt mit dem Regaudschen
Hamatoxvlin and Bordeaux R. Vergross. 1000
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V. Sosnovci: Anatomisch-zytologisehe Studie fiber die Plastiden
der Vegetationspunkte.
21 A
i!.
A4A
2
1d v
/Il S'
gelb IBM schwachrot
gelbrot ~ rot
Abb. 7-10. Schema der Entwicklung der Vegetationspunkte and die Chlorophyllstrahlung unter dem
Standard-Fluoreszenzrnikroskop (Reichert). Das Datum bezeichnet den rag der J3eobaehtung, die
bei Nurnmer den Vegetationspunkten die Zahl der gleichen Beobachtungen.
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Abb. 1. Junge Zellen des Weizenendosperms (Niva). Kleine, granumahnliche Mitochondrien an der Sicht-
barkeitsgrenze, die sich vergrossern. Fixierung nach Zirkle-Erliki, Farbung mit Eisenhamatoxylin nach
Regaud.
Abb. 2. Zytoplasma der Zellen aus dem Randgebiet des Endosperms. Vakuolisation der Mitochondrien.
Links Starkekorner. Fixierung nach Zirkle-Erliki, Farbung mit Eisenhamatoxylin.
Abb. 3. Zelle aus dem Randgebiet des Endosperms. Plastiden and Starkekorner. Fixierung and Fdrbung
wie bei den vorigen Objekten.
Abb. 4. Vegetationspunkt bei einem Keim 2 Stunden nach der Ankeimung. Im Zytoplasma gekorntes
verschiedenartiges ergastisches Material. Fixierung and Farbung wie bei den vorigen Objekten.
(2000fache Vergrosserung).
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Abb. 5. Keimendor Reis (Dunghan tihaly) 4 Stunden nach deni Ankeimmngsbeginn. Zellen unterhalb des
V-egetationspunktes. Granumahnliche Mitochondrion and Stiirkekiirner. Fixierung Hach Holly, Farbung
mit Altnnrnnschem Fuchsin-Tannin-Met hylgriin nach Milovidov (201)0faehe Vergriisserung).
.abb. 6. Zellen der 131attanlagen im Reiskeiinling. In der Zello reelits zwei entwickelte Spharoplosten.
Fixierung Hach Hell', Farbung mit Kristallviolett nach Benda (3000faoho V'orgrosserung).
Abb. 7. A%egetationspunkt sines AVeizenkeimlings 48 Stunden nach Ankeinntngsbeginn. Fixierung and
Farbung nach Ciaeoio-Lison (Chrornsaure-Kaliumbichrorna,t-Foruu)I-ISsigeaure, Sudanschwerz).
Der Vegotationspunkt and die Zellen outer diesem farben sieh int ?nsiv mit Sudan sohwarz (400faoin
Vergrdsscrung).
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Abb. 8. Zellen der Blattanlagen bei 8 Tage unter Wasser im Dunkeln angekeimtem Reis. Vermehrung der
Spharoplasten, die rich mit Eisenharnatoxylin zu farben beginnen. Stabchen- and fadenformige mito-
chondriale Strukturen. Fixierung nach Helly, Farbung mit Eisenhamatoxylin nach Regaud
Abb. 9. Plastiden der Blattanlagen bei gleichaltrigem, in feuchtem Milieu im Licht geziichtetem Reis.
Ovale, aus mitochondrialen Gebilden entwickelte Plastiden
(2000fache Vergrosserung).
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Abb. 10. Entwickelto Plastiden and Mitochondrien bei dean im Dunkeln gezilchteten Reis.
Abb. 11. Entwickelto Plastiden and Mitochondrien bei den im Licht geztichteten Pflanzen 7 Tage nach
der Ankeimung. Fixierung nach Belly, Farbung xnit Eisenhamatoxylin
(2000fache Vergrosserung).
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